ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Непрямое Уф-детектирование катионов из "Руководство по капиллярному электрофорезу" Теоретические выкладки показывают, что ЭОП и движение катионов в капиллярах из плавленного кварца имеют одинаковое направление, поэтому аппаратура КЭ для разделения катионов должна быть такой полярности, чтобы выход был заземлен. [c.59] Таким образом, перенос ионов в ЭОП при КЭ налагается на движение катионов. Это дает возможность осуществить их быстрое разделение. В качестве буферной системы в этом случае хорошо подходит имидазол с концентрацией 5 мМ и значением pH ниже 6.0. Как показано на рис. 48, разделение заканчивается меньше, чем за 4 минуты. Примерно через 5.5 минут на электрофореграммах появляется большой пик, вызванный ЭОП. Он объясняется введенной водой, которая обладает меньшим УФ-поглощением, чем буферная система, и тем самым вызывает каждый раз отрицательный пик, с помощью которого можно определить ЭОП. [c.59] Из формы пиков ясно видно, что подвижность имидазола близка к подвижности кальция. [c.59] Используя низкоконцентрированный буфер (2 мМ) и значение pH 6.0, при большом напряжении электрического поля можно вызвать большой ЭОП и легко сократить время анализа. [c.60] На коротком участке разделения анализы проводятся очень быстро. Как показано на рис. 49, в поле 1300 В/см (30 кВт) тестовые ионы разделяются менее, чем за 30 с, при этом проявление пиков, несмотря на высокую напряженность поля, очень хорошее. При таком разделении можно, к примеру, для пика кальция достичь 600 тыс. тарелок на метр или, нормируя на время, - 320 тыс. тарелок в минуту. Сильным полем ионы ускоряются до скорости движения 0.96 см/с без существенного изменения профиля потока и проявления пиков. [c.60] Среди факторов, влияющих на детектирование, решающую роль играет прежде всего селективность разделяющих систем. [c.60] Как можно показать с помощью теоретических выкладок, использование ионов буфера с большими молярными коэффициентами экстинкции приводит к более чувствительному детектированию. Молярный коэффициент экстинкции в УФ-спектре имидазола в максимуме при 205 нм составляет 5000. Имидазольный буфер можно использовать в области от 190 до 220 нм для непрямого детектирования, т.е. область применения ограничена нижней УФ-областью. Вследствие того, что многие вещества также поглощают в УФ-области, при детектировании могут возникать помехи. Расширение области непрямого детектирования в сторону более высоких длин волн и/или в область более щелочных значений pH достигается 4-аминопиридином (4-АП). В максимуме поглощения при 205 нм 4-АП обладает молярным коэффициентом экстинкции 15500, при 245 нм - около 15600. При 254 нм существует еще один пик с экстинкцией около 14000. Это примерно в три раза больше, чем молярный коэффициент экстинкции имидазола при 214 нм. Подвижность 4-АП примерно такая же, что и у имидазола. Преимущество 4-АП проявляется в том, что ом применим в более широкой области длин волн - даже при 270 нм можно проводить непрямое детектирование. Кроме того, буфер 4-АП можно использовать до значений pH 10.1 без уменьшения чувствительности буферной системы вследствие исчезновения заряда 4-АП. [c.61] В таблице 19 приведены другие буферные системы, применяемые для разделения катионов с непрямым детектированием. По подвижностям ионов пробы можно выбрать подходящий разделяющий буфер. Значения рКз берутся из литературы или определяются титрованием. Соответствующие УФ-спектры важнейших буферных компонентов представлены на рис. 51. [c.61] Воспроизводимость разделения в ионной аналитике при применении буферных систем очень хорошая. ОСО времен миграции лежат ниже 0.5%, воспроизводимость площади пика - важнейшая величина для количественных анализов - лучше 2.3%. Наряду с точностью для количественных расчетов важной величиной является их достоверность, которая подтверждается данными других методов. В качестве альтернативных методов измерения выступают атомно-абсорбционный анализ, ИОХ, а также ионный анализ с ионно-селективными электродами. Как показывают некоторые примеры, результаты, полученные различными методами анализа, в пределах известных допустимых отклонений совпадают. Определение щелочных и щелочноземельных катионов в байкальской воде показано на рис. 52. [c.61] Для подтверждения полученных результатов эти же пробы воды изучали методами ИОХ, а также атомно-абсорбциомной спектроскопии (ААС). [c.61] При этом в методе ИОХ анализ пробы проводили по циклической схеме с применением синтетического ионита с детектором по электропроводности, а анализы методом ААС - по стандартному методу Шинкеля. Между найденными концентрациями ионов наблюдалось хорошее согласие. [c.61] Важнейшие параметры катионных буферных веществ. [c.61] В качестве другой пробы, для которой имелись в наличии контрольные данные, полученные другими аналитическими методами, изучали воду из лесного родника. Для минеральной воды лесного источника результаты анализов, полученные всеми тремя методами, приведены в таблице 20. Дополнительно здесь же приведены концентрации ионов, имеющиеся на этикетке бутылок с этой водой. [c.62] Более проблематичен анализ катионов в крови. Размеры красных кровяных шариков составляют 7 5x2 мкм и граничат с размерами частиц, которые можно вводить в КЭ без проблем. После разжижения свежей крови в 100 раз эта проба уже не в состоянии коагулировать. Красные и белые кровяные тельца крови не допускают прямого ввода пробы в методе ВЭЖХ. Содержание белков в этих разжиженных растворах всегда выше 0.7 г/л, так что белки составляют существенную часть пробы. Несмотря на это, разделение катионов методом КЭ вследствие их очень высокой подвижности по сравнению с компонентами пробы не представляет большой проблемы. [c.63] Вследствие высокой чувствительности, детектирование ионов удается провести даже в таком разжиженном растворе. Значения концентраций, определенные по сравнительному методу с внешней сравнительной кривой, соответствуют литературным данным. Для калия найдено значение 6.8 мг-экв/л (литературное значение 5 мг-экв/л), для натрия - 147 мг-экв/л (литературное значение 150 мг-экв/л), для кальция - 3.4 мг-экв/л (литературное значение 2 мг-экв/л) и для магния - 5.4 мг-экв/л (литературное значение 3 мг-экв/л). [c.63] Белки в растворе все же нарушают воспроизводимость разделения. На рис. 54 показаны времена миграции и площади пиков кальция для первых восьми вводов пробы. [c.63] В результате адсорбции белков, которые при каждом вводе пробы достигают капилляра, силанольные группы на стенках капилляра, ответственные за ЭОП, все более и более блокируются. По этой причине ЭОП замедляется, и ионы движутся к детектору медленнее. Уменьшение скорости движения напрямую отражается на площади пиков. С увеличением времени миграции ионы медленнее проходят через детектор, из-за чего площадь пиков растет. Этим объясняется ход кривых зависимости площади пика от времени миграции, приведенных на рис.54. [c.63] Нормировка площади пика на время миграции является лишь вычислительным приемом с результатами анализа. Однако, причина изменения времени миграции все же остается. Несмотря на это, путем такой нормировки ОСО площади пика уменьшается с 6.2% до 2.8%. Приемлемым решением этой проблемы является подготовка капилляра перед каждым пуском. В анализах, описанных до настоящего времени, для кондиционирования капилляра применяли только промывание разделяющим буфером в течение 3 мин. [c.64] Для удаления белков из капилляра после каждого разделения во второй серии измерений капилляр сначала промывали в течение 5 минут 0.1 М МаОН и затем 5 минут разделяющим бусрером. Этим способом кондиционирования можно было удалять со стенок капилляра мешающие вещества, внесенные пробой, и в конце концов восстановить свойства капилляра новым буфером. Характеристическая кривая зависимости площади пика от времени миграции в этих случаях не имеет наклона, времена, как и площади пиков, колеблются произвольно. Воспроизводимость площади пика для кальция составляет после 8 вводов пробы 2.0%. Если площадь нормировать дополнительно на время, это значение составляет 1.5%. [c.64] Амины также могут легко протонироваться, и, так же как ионы металлов или аммония, их можно легко разделять. Типичные значения pKs для алифатических аминов лежат в области от 9.5 до 10.8. На рис. 56 в качестве примера представлено разделение ионов металлов, аминов и аминоспиртов. И в данном случае непрямое УФ-детектировамие достигается имидазольной буферной системой. Благодаря высокому разрешению пиков, все вещества, как видно из рисунка, отделены друг от друга на уровне базисной линии. [c.64] Вернуться к основной статье