ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Реитгеноструктуриый анализ из "Молекулярная биофизика" Современное естествознание пользуется двумя главными методами для изучения строения вещества. Эти методы — химия и оптика в щироком смысле слова, т. е. изучение взаимбдействия вещества со светом во всем допустимом диапазоне длин электромагнитных волн — от рентгеновских до радиоволн. Химия рас-щифровывает первичную структуру белковых цепей, а также структуру функциональных центров белковых глобул, а частности активных центров ферментов (см. гл. 6). Однако химия (биохимия) как таковая не может установить пространственное строение молекулы белка или нуклеиновой кислоты. [c.265] Дифракция рентгеновских лучей на кристаллах происходит потому, что периоды рещетки, межатомные расстояния й в рещетке (1—4 А) имеют тот же порядок величин , что и длины волн (чаще всего пользуются /Са-излучением Си с X = 1,54 А). [c.265] Сечения отражающих плоскостей в ортогональной кристаллической решетке. [c.268] Следовательно, только узлы, находящиеся на поверхности сферы, отвечают условиям дифракции. [c.269] Узлы обратной решетки обычных низкомолекулярных кристаллов расположены редко, так как малы периоды решетки а, Ь с н соответственно велики периоды а, Ь, с. [c.269] Не зная фаз, мы не можем установить структуру объекта. Как пишет Перутц [1], рентгенограмма кристалла оказывается иероглифом без ключа для его расшифровки . Метод определения фаз, развитый Перутцом применительно к белкам, состоит в том, что к молекулам, образующим кристалл, присоединяют тяжелые атомы, например атомы ртути. Тяжелый атом, т. е. атом, имеющий большую силу рассеяния, вызывает заметные изменения интенсивности дифракционных пятен. По разности амплитуд в отсутствие и в присутствии тяжелого атома можно определить фазу — тяжелый атом берется за исходную точку. Применение производных белка, содержащих несколько тяжелых атомов, позволяет решить проблему фаз однозначно. Необходимым условием при этом является полное сохранение структуры белкового кристалла при введении тяжелых атомов. Иными словами, здесь мы имеем дело с методом изоморфного замещения — ртутные производные белка дают кристаллы, изоморфные кристаллу незамещенного белка (см. [2]). [c.271] До сороковых годов рентгенография сравнительно простых соединений подтверждала их структуру, установленную химическими методами, и давала количественные сведения о межатомных расстояниях. В 1944 г. Ходжкин впервые расшифровала структуру пенициллина, которую химикам не удавалось определить. Молекула пенициллина содержит 23 атома кроме атомов водорода. Далее Ходжкин установила структуру витамина В12. Здесь были определены координаты уже 93 атомов. В дальнейшем рентгенографию начали применять в исследованиях наиболее сложных молекул — молекул белков. Основоположником этого важнейшего направления молекулярной биофизики был Бернал, и крупнейшие достижения в изучении белков принадлежат кембриджской научной школе. Они связаны с именами Брэгга, Кендрью и Перутца. В 1957 г. Кендрью установил пространственное строение первого белка — миоглобина (см. стр. 231). В молекуле миоглобина более 2500 атомов. [c.272] Кристаллы белка содержат большое количество воды, и их исследуют в маточном растворе. Бернал и Ходжкин впервые воспользовались этим методом и получили десятки тысяч четких рефлексов на рентгенограммах. Число рефлексов может доходить до сотен тысяч. Расшифровка столь сложных рентгенограмм — очень трудная и длительная работа, которую можно провести, лишь пользуясь ЭВМ. Для точного определения фазы, соответствующей каждому рефлексу, необходимо измерить несколько раз его интенсивность при дифракции как от чистого белка, так и от его производных, содержащих тяжелые атомы. В расчетах фигурируют десятки миллионов чисел. [c.272] Пространственное распределение плотности можно сделать видимым, например, наложением друг на друга контурных карт, начерченных на стопке листов прозрачного пластика. Соответствующая картина для миоглобина показана на рис. 5.6. Окончательным результатом исследования является пространственная модель молекулы белка, в которой определены положения всех его атомов. Такие модели приведены на стр. 231. [c.272] С другом. В частности, совпадают степени спиральности, определенные обоими методами (см. далее стр. 319). Более того, установлено, что биологическая функциональность (ферментативная активность) белка сохраняется в кристалле, так как он сильно гидратирован. Пока что нет оснований сомневаться в положительном ответе на поставленный вопрос. Напротив, белки, подвергнутые лиофильной сушке, по-видимому, изменяют структуру — рентгенограммы высушенных кристаллов белка очень бедны рефлексами. [c.273] Здесь кратко изложены лишь физические принципы рентгенографии глобулярных белков — подробное изложение теории и методов приводится в ряде монографий и статей [3, 12, 270]. [c.273] Рентгеноструктурный анализ, будучи прямым методом исследования, дает особенно обширную и ценную информацию о строении белков, позволяющую прийти к выводам, имеющим общее значение для биофизики (см. гл. 6 и [12]). [c.274] В табл. 5.1 приведен список белков, исследованных рентгеноструктурными методами. Он составлен в начале 1971 г. и, конечно, неполон (см. [270]). Ряд других белков и полипептидов был исследован пока с меньшим разрешением ( -. и б-химотри-псин, карбоангидраза С, эластаза, конканавалин, пепсин, трипсин, глюкагон, окситоцин и т. д.). Изучались также красивые и сложные надмолекулярные структуры, образуемые каталазой [30]. [c.274] Несомненно, в ближайшее время число детально изученных белковых молекул возрастет. [c.274] Малость длины дебройлевской волны для электрона означает большой радиус сферы Эвальда (см. стр. 268), ее вырождение в плоскость. Это сильно упрощает истолкование электро-нограмм, так как они оказываются прямыми изображениями плоского сечения обратной решетки кристалла. Атомные факторы для рассеяния электронов также пропорциональны атомному номеру, но по своей абсолютной величине они во много раз больше, чем для рентгеновских лучей. Иными словами, электроны взаимодействуют с веществом значительно сильнее, чем рентгеновские кванты. Поэтому они сильно поглощаются веществом, и для исследования его структуры необходимо пользоваться очень тонкими пленками толщиной порядка 10 —10 см, тогда как размеры кристаллов, изучаемых в рентгенографии, порядка 10 см. Исследование необходимо проводить в высоком вакууме. Это делает невозможным применение электронографии для изучения глобулярных белков в их нативном состоянии — вакуум высушит белок. Тем не менее электронография позволяет получить ценные результаты при исследовании фибриллярных белковых структур, синтетических полимеров и других аморфных тел. Существенное преимущество электронографии состоит в том, что она позволяет локализовать атомы водорода (подробное изложение см. в монографиях [31, 32]). [c.275] Для нейтронографических исследований необходимы атомные реакторы, дающие мощные пучки нейтронов, которые подвергаются монохроматизации отражением от кристаллической пластинки (например, СаРз). Дифрагирующие нейтроны регистрируются счетчиками. Нейтроны рассеиваются не электронной оболочкой атома, но его ядром, и атомный фактор определяется конкретной протонно-нейтронной структурой ядра, а не атомным номером. Поэтому атомные факторы изотопов существенно различаются. Атомный фактор для водорода (протона) далеко не минимален, для ряда тяжелых элементов он меньше. Поэтому нейтронография позволяет надежно локализовать атомы водорода с ее помощью была установлена структура льда (см. стр. 203). Можно высказать уверенность в том, что нейтронография в будущем сыграет важную роль в изучении биополимеров, где она до сих пор почти не применялась (дальнейшие подробности см. в [33]). [c.275] Вернуться к основной статье