ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Разработка и описание условий анализа из "Аналитическая хроматография" Использование литературных данных. Желательно, чтобы еще до начала работы было сделано обобщение литературных сведений по решению стоящей задачи с помощью ВЭЖХ и другими методами. Они, несомненно, окажут большую помощь, позволят справиться с проблемой за более короткое время. В то же время значение этой информации не следует переоценивать, и не всегда надо пытаться слепо воспроизвести опубликованный режим. Это, разумеется, не относится к методикам, имеющим силу стандартов их необходимо воспроизводить буквально и досконально. Трудности при воспроизведении методик, опубликованных в литературе, связаны с рядом обстоятельств неидентичность технических данных оборудования, имеющегося в распоряжении разных лабораторий неидентичность сорбционных свойств однотипных неподвижных фаз и даже разных партий одной и той же неподвижной фазы недостаточная полнота описания методик недоступность тех или иных реактивов, растворителей, материалов и приспособлений. [c.318] Кроме того, при анализе литературных данных почти всегда оказывается, что проблема, которая стояла перед авторами публикации-прототипа, отличается от той проблемы, которую предстоит решить аналитику, хотя основные определяемые соединения могут быть одни и те же. Это также отчасти обесценивает опубликованную методику, так как в конкретном случае может потребоваться другая подготовка пробы, могут оказаться иными состав примесей, фоновые вещества в биообъекте и т. п. [c.318] Сложилась практика указания в методиках разделения таких простых и физически наглядных параметров, как геометрические размеры колонок, расход подвижной фазы, время удерживания. Однако основной результат хроматографического процесса — разделение — напрямую связан не с этими параметрами, а со специфическими характеристиками термодинамической и кинетической природы, в первом приближении не зависящими от геометрических характеристик хроматографической системы — коэффициентами емкости, эффективностью и т. п. Поэтому при описании результатов хроматографических экспериментов коэффициенты емкости, эффективность, линейная скорость подвижной фазы должны указываться наряду с приведенными выше характеристиками. В большинстве случаев хроматографисты пользуются стандартным рядом длин колонок 25, 15 или 10 см. Многйе фирмы освоили выпуск более коротких колонок (вплоть до 3 см), заполненных особо мелкозернистыми сорбентами. Однако из теоретических основ метода ясно, что сама по себе длина колонки влияния на качество разделения не оказывает, а ее увеличение способствует увеличению продолжительности разделения. Действительно определяющим фактором является эффективность колонки, и именно ее необходимо указывать, описывая разделение. Это позволяет осознанно подходить к воспроизведению методик разделения и одновременно использовать возможности сокращения продолжительности анализа. Так, допустим, что согласно опубликованной методике разделение выполнялось на колонке длиной 25 см и эффективностью 5000 теоретических тарелок. По современным воззрениям такая колонка не может считаться высококачественной, однако примеров подобного рода в литературе, и даже новейшей, более чем достаточно. В настоящее время для получения указанной эффективности достаточно колонки длиной 10 см или даже 5 см. Поэтому имеется реальная возможность, сохранив все остальные параметры опыта постоянными, воспроизвести ранее достигнутое качество разделения на более короткой колонке и за более короткое (в 2,5—5 раз) время. Следовательно, выбор длины колонки и эффективности в каждом конкретном случае определяется той селективностью, которой обладает данная система по отношению к разделяемым соединениям, а также требованиями к быстроте разделения. [c.319] В руководствах прежних лет отмечалось, что последовательное соединение колонок с целью увеличения суммарной эффективности положительного результата не дает. Вероятнее всего, такое мнение сформировалось из-за пользования недостаточно соверщенными соединительными элементами. Наш опыт и данные, опубликованные в последние годы, говорят о том, что последовательное соединение колонок вполне осуществимо и эффективность при этом примерно равна сумме эффективностей отдельных колонок. Этим путем, однако, хроматографисты идут довольно редко, так как за удвоение эффективности приходится платить резким увеличением продолжительности разделения, работой насосов вблизи максимальных рабочих давлений. [c.320] Способ элюирования. В ходе разработки методики разделения многокомпонентной смеси необходимо решить вопрос о режиме элюирования. Анализ современных тенденций в жидкостной хроматографии показывает, что градиентное элюирование довольно редко применяют для анализа химических продуктов, но оно необходимо при разделении сложных смесей биологического происхождения. Существенным недостатком градиентного элюирования является то, что возврат к исходному режиму элюирования по окончании разделения требует довольно значительного времени (чаще всего 15—30 мин). При сравнении возможностей.градиентного и изократического элюирования продолжительность приведения колонки в исходное состояние следует суммировать с продолжительностью градиентного разделения. При таком подходе часто оказывается, что лучше провести длительное изократическое разделение, чем незначительно уступающее ему по продолжительности градиентное. [c.320] При экспериментальном подборе условий разделения можно рекомендовать следующий порядок опытов. Первоначально берут такой состав подвижной фазы, в котором предположительные значения коэффициентов емкости будут в пределах 0,1—0,5. В этом режиме хроматографируют искусственную смесь, а также реальный образец. Из хроматограммы искусственной смеси делают вывод, насколько надо уменьшить силу подвижной фазы, чтобы приблизиться к оптимальным значениям к. Хроматограмма реального образца, снятая в первом режиме, позволяет выявить наличие сильносорбирующихся примесей, которые могли бы быть потеряны при хроматографировании в более слабой подвижной фазе. [c.321] При исследовании закономерностей хроматографического поведения, стандартизации величин удерживания условия эксперимента необходимо выбирать таким образом, чтобы погрешность измерения коэффициентов емкости была по возможности мала. Это достигается уже при к = 4. Выбор несорбирующихся веществ, необходимых для измерения объема подвижной фазы в колонке и вычисления к, является предметом продолжающейся дискуссии в литературе. Вероятно, идеального решения этой задачи не существует, и наиболее рациональный выход — принять в качестве условно несорбирующихся такие соединения, которые применяют с этой целью чаще всего. [c.321] В случае обращенно-фазовой хроматографии в качестве условно несорбирующегося вещества при работе с УФ-детектором можно рекомендовать нитрат натрия, а при работе с рефрактометром — воду. В нормально-фазовом варианте такими веществами могут быть соответственно тетрахлорид углерода и гексан. [c.321] Термостатирование колонки при повышенных (до 40—60 °С) температурах можно рекомендовать в тех случаях, когда используют подвижные фазы большой вязкости. Это позволяет значительно снизить давление в системе и расширить круг используемых растворителей. Например, при 60 °С становится возможным использование в качестве органического компонента подвижной фазы в обращенно-фазовой хроматографии. [c.322] Применение термостатирования может также быть необходимым при прецизионных физико-химических измерениях. [c.322] Расход подвижной фазы выбирают в зависимости от внутреннего диаметра колонки, технических данных насоса, свойств разделяемых соединений. С точки зрения возможности воспроизведения методик, было бы более правильным задавать не объемный расход через все сечение колонки, а расход через единицу сечения либо линейную скорость подвижной фазы. Тем не менее, поскольку насосы ВЭЖХ градуированы в единицах объемного расхода, именно этот параметр, как правило, приводится в описаниях методик. [c.322] Для ниэкомолекулярных сорбатов характерно довольно незначительное уменьшение эффективности разделения с увеличением скорости подвижной фазы, что в принципе позволяет сильно сократить продолжительность разделений. Однако этой возможностью пользуются довольно редко, так как пропорционально расходу увеличивается давление на входе в колонку. В результате используемые разными авторами величины расхода подвижной фазы колеблются в сравнительно узких пределах. Так, почти все разделения на колонках внутренним диаметром 4,6 мм выполняют при расходе фазы от 1 до 2 мл/мин, что соответствует линейной скорости 1,5—4 мм/с (при характерных для ВЭЖХ значениях фазового отношения). Именно эта величина представляет собой наиболее разумный компромисс между продолжительностью разделения и давлением. Разумеется, при разделении на колонках иного диаметра расход следует изменить пропорционально площади поперечного сечения колонки. [c.322] При выборе объема и концентрации пробы руководствуются требуемой точностью дозирования, предельно допустимыми режимами разделения и детектирования. [c.323] Погрешность дозирования проб, как правило, снижается с увеличением их объема. Следовательно, когда этот показатель является существенным (например, при количественной обработке хроматограмм методом абсолютной калибровки), целесообразно выбирать максимально допустимый для данных условий объем. Использование проб слишком большого объема может привести к заметному снижению эффективности разделения, особенно при работе с колонками эффективностью 10 000—20 ООО теоретических тарелок. Чтобы реализовать всю эффективность, присущую данной колонке, объем пробы не должен превышать 1/10 часть объема, соответствующего ширине хроматографического пика на половине его высоты. Предельный объем проб возрастает пропорционально площади поперечного сечения слоя сорбента. Для колонок внутренним диаметром 4,6 мм и эффективностью свыше Ю теоретических тарелок он составляет примерно 25 мкл. [c.323] Вернуться к основной статье