ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Гель-проникающая хроматография изомеризуклцихся систем из "Хроматография полимеров" Понятно, что интерпретация хроматограмм для определения молекулярно-массовых распределений полидисперсных полиэлектролитов, пол енных в условиях сильной концентрационной зависимости удерживаемых объемов, задача очень сложная. Гораздо проще попытаться подавить эффект полиэлектролитного набухания и, избавившись таким образом от концентрационной зависимости, провести интерпретацию хроматограмм по стандартной методике на основании калибровочной зависимости (1У.20). [c.166] 01 моль/л). В этих условиях хроматограммы образцов ПАК соответствовали их молекулярно-массовым распределениям и могли быть-интерпретированы в соответствии с зависимостью (1У.20). Это было подтверждено повторным хроматографированием узких фракций ПАК (рис. 1У.26) каждая из этих фракций выходила с соответствующим именно ей удерживаемым объемом. [c.168] Подобная процедура проверки концентрационной зависимости и рефракционирование должны быть проведены при анализе методом ГПХ нолиэлектролитов. [c.168] Возможности использования макропористых стекол для ГПХ нолиэлектролитов ограничиваются поликислотами, поскольку по-лиамфолиты (белки) и поликатионы на них необратимо адсорбируются. [c.168] При определении молекулярной массы биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.) необходимо учитывать взаимодействие их макромолекул между собой и связанное с ним образование ассоциатов, изомеров и комплексов. Для этой цели удобно использовать такие методы анализа, как седиментация, электрофорез и хроматография. С их помощью можно добиться некоторого разделения компонентов белкового раствора и распределения их в соответствии с определенным законом, который может быть строго описан математически. Сравнивая затем экспериментальное и теоретическое распределения, можно определить параметры, характеризующие взаимодействие макромолекул, восстановить распределение каждого компонента и, наконец, найти по ним молекулярную массу неассоциированных молекул, т. е. мономеров белка. [c.168] Первое сообщение о таких работах было сделано Джильбер-том [77] в 1955 г. В нем говорилось о возможности электрофоретического и седиментационного изучения обратимых взаимодействий белков, нелинейности дифференциальных уравнений, описывающих эти взаимодействия, асимптотическом поведении решений для некоторых частных случаев. В работах Джильберта [78— 80], а также других исследователей [81—88] была развита теория электрофореза и седиментации для случаев некоторых кинетически контролируемых взаимодействий. Для описания протекающих при этом процессов был разработан численный компьютерный метод, в котором транспортная система (например, кювета центрифуги) разбивалась на слои. Предполагалось, что внутри каждого такого слоя существует равновесие между компонентами, изменяющееся скачкообразно при переходе от одного слоя к другому. [c.169] С появлением гель-проникающей хроматографии стало возможным хроматографическое изучение взаимодействующих белковых систем [89—98]. При этом такнад пришлось столкнуться с нелинейностью дифференциальных уравнений, описывающих ГПХ-процесс белков, и сложностью интерпретации экспериментальных данных. [c.169] Одной из таких систем является смесь однотипных белковых молекул в клубкообразном и глобулярном состояниях, когда переход глобула — клубок является настолько резким, что можно говорить о двух состояниях с различными свойствами. [c.169] Определяя экснериментально дисперсионный коэффициент Ly и сравнивая его значение, а также концентрацию раствора на выходе из хроматографа с теоретическими значениями Ly и с, полученными по формулам (IV. 37—IV. 39), нетрудно определить константы скорости изомеризации и к [94]. [c.172] При этом нулевые моменты S определяют количество каждого компонента, введенного в колонку. Первые моменты Mi i задают положения Xi — центров масс компонентов = г/ , . Вторые центральные моменты задают дисперсию компонентов af.(i=l,2). Выран ения для а, х , al отличаются от (IV.40—IV.42) порядком следования индексов 1 и 2 . Впервые подобные расчеты были проведены в работе [95]. [c.172] Анализ выражений (IV.40—IV.42) и (IV.46, IV.47) позволяет установить следующие закономерности хро матографического поведения двухкомпопентной смеси изомеров, удовлетворяющей условиям (IV.23, IV.24) и (IV.33, IV.34) [95] (рис. IV.27). [c.173] каждый компонент движется и размывается с характерными для него скоростью Л] и дисперсией а . [c.174] Выражения (1У.4б, IV.47) для статистических моментов позволяют определять константы, характеризующие скорость реакции изомеризации белков. С этой целью в формулы (IV.46, IV.47) следует подставить значения моментов, найденные с помощью стандартной процедуры по хроматограммам с х, 1), а также определить из независимых хроматографических экспериментов параметры 5,-, и разрешить получившиеся таким образом уравнения относительно ку и к . Эксперименты, в которых определяют параметры Ь , 7 , следует проводить в условиях, когда равновесие смещено в сторону одного из компонентов. При этом изомерная смесь вырождается в однокомпопентный раствор, состоящий из изомеров только одного типа. В слз ае, когда параметры каждого из изомеров изменяются под действием внешних условий (например, pH), необходимо провести экстраполяцию значений этих параметров к условиям эксперимента. Хроматограммы с х, удобно получать сканированием хроматографической колонки в фиксированный момент времени с помощью УФ-спектрофото-метра [89]. При отсутствии такой возможности можно использовать для расчетов элюционные кривые с х, t), полученные при детектировании раствора на выходе из колонки и дающие распределение вещества во времени в подвижной фазе хроматографической системы при фиксированном значении х, равном длине колонки Ь. Однако такая постановка эксперимента дает возможность получить только временные статистические моменты распределения с х, 1) при х — Ь. Строгие аналитические выражения для них получить трудно, но можно использовать простые соотношения, достаточно точно связывающие временные моменты t и 0 с пространственным хжа -. [c.175] Смысл соотношения (IV. 54) заключается в том, что математическое ожидание концентрации по пространственной координате в средний момент времени выхода пика приходится на конец колонки. Это должно строго выполняться для очень узкого (дельтаобразного) распределения. Оба соотношения (1 .54) и (IV. 55) были бы точными и в том случае, когда за время перемеш ения максимума распределения на расстояние, равное его полуширине, скорость движения оставалась постоянной, равной [ а, или, иными словами, если бы распределение с х, t) перемещалось целиком со скоростью С/о как замороженное . [c.176] Определив константы изомеризации, нетрудно затем восстановить распределение каждого компонента С (х, 1) на выходе из хроматографической системы и, воспользовавшись ее калибровкой, найти молекулярную массу белка. При этом для изомера в клубкообразном состоянии можно применять универсальную калибровочную зависимость Бенуа, а для глобулярного изомера — специальную калибровку по стоксовым радиусам белковых молекул [89] или по их молекулярным массам (рис. IV.28, IV.29). [c.176] Вернуться к основной статье