ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Определение аминокислот в белках и в белковых гидролизатах из "Химия и биология белков" НОСТИ цветных реакций. Эти попытки, однако, не имели достаточного основания, поскольку окраска, получаемая с белками, как правило, слабее окраски, получаемой с соответствующими белковыми гидролизатами. Это обусловлено, по всей вероятности, тем, что в белковой молекуле некоторые реактивные группы скрыты внутри глобулы и вследствие этого недоступны действию окрашивающего реагента (см. гл. VII). Поэтому для определения аминокислотного состава белка необходимо подвергнуть его полному гидролизу. Большинство аминокислот можно определить в кислотном гидролизате, однако некоторые аминокислоты обнаруживаются только после гидролиза белка гидроокисью бария (см. выше). Разделение смеси аминокислот представляет собой трудную задачу, так как аминокислоты являются амфолитами, растворимыми в воде и нерастворимыми в таких органических растворах, как спирт. Только иминокислоты пролин и оксипролин раство римы в этиловом спирте. Ввиду того что аминокислоты обладают сходными физико-химическими свойствами, их нельзя разделить фракционированием спиртом или нейтральными солями. Некоторые аминокислоты можно, однако, отделить путем осаждения их при соответствующих условиях. Например, растворимость цистина при нейтральной реакции и тирозина при слегка кислой реакции настолько мала, что при доведении реакции среды до соответствующего значения pH они почти полностью выпадают в осадок. Другие аминокислоты можно осадить специфическими реактивами. Однако ни один из этих методов не является полностью удовлетворительным в количественном отношении, так как все соответствующие осадки до известной степени растворимы. [c.31] Интенсивность роста бактерий на этой среде сравнивается с интенсивностью роста бактерий на синтетических средах того же состава, но содержащих, кроме того, различные количества определяемой аминокислоты. Измеряя интенсивность роста бактерий при разных концентрациях определяемой аминокислоты, получают стандартную кривую, по которой и вычисляют содержание аминокислот в анализируемом материале [64]. [c.34] Новым методом идентификации аминокислот и их количественного определения является также спектрофотометрия в инфракрасном свете. Каждая аминокислота и каждая а-хлорокис-лота (получаемая при действии соляной и азотной кислот на аминокислоты) имеют характерную кривую поглощения в инфракрасном свете [68]. При помощи спектрофотометрии в инфракрасном свете было показано, что определение лейцина и изолейцина микробиологическим методом дает слишком высокие величины [69]. [c.35] Аминокислоты, получающиеся в результате полного гидролиза белка, представляют собой оптически активные соединения (если гидролиз не сопровождается рацемизацией). Все выделенные из хорошо известных белков аминокислоты имеют одну и ту же конфигурацию, т. е. одинаковое пространственное расположение четырех радикалов у сс-углеродного атома, хотя одни аминокислоты являются правовращающими, другие — левовращающими. Все аминокислоты, встречающиеся в природе, относятся к -ряду. Их взаимная связь доказывается путем превращения в идентичные производные [70]. В некоторых алкалоидах спорыньи и бактериальных токсинах найдены оптические стереоизомеры этих природных аминокислот — неприродные -аминокислоты (см. гл. XV) [70]. Глицин оптически неактивен, так как он не содержит в своей молекуле асимметрического углеродного атома. [c.35] Существует множество методов, служащих для определения индивидуальных аминокислот, причем некоторые из этих методов являются абсолютно специфическими. Ниже мы помещаем описание этих методов. [c.35] Определение валина, лейцина и изолейцина. При действии нингидрина на эти аминокислоты (И), (П1) и (IV) также образуются летучие альдегиды, которые можно определить, как описано выше [76]. Количество каждой из трех указанных аминокислот можно определить также микробиологическим методом [64, 77]. Лейцин, в связи с его плохой растворимостью, можно определить методом изотопного разведения [61]. [c.36] В ферментных гидролизатах глутамин может быть определен путем нагревания нейтрализованного гидролизата до 100° [84]. Глутамин при этих условиях быстро гидролизуется и дает эквивалентное количество аммиака, аспарагин же не претерпевает никаких изменений [85]. [c.37] Определение оксиаминокислот. При окислении оксиаминокис-лот йодной кислотой (ШО4) серин (VII) превращается в формальдегид, а треонин (VIII) — в ацетальдегид, причем освобождается эквивалентное количество аммиака [86]. По количеству отщепленного аммиака можно определить сумму оксиаминокислот. Аммиак образуется также при действии йодной кислоты на оксилизин — аминокислоту, найденную в заметных количествах только в желатине [87] (остальные белки содержат лишь следы оксилизина). Для определения оксилизина белковый гидролизат осаждается фосфорновольфрамовой кислотой, и получившийся осадок обрабатывается перйодатом [87, 88]. [c.37] НгН—СН—СООН НООС—СН—ННо. [c.38] Определение метионина. Для количественного определения метионина (XII) выгодно использовать его способность образовывать иодистый метил при нагревании с иодистоводородной кислотой. Освобождающийся иодистый метил определяется титрованием [99]. Метионин дает красную окраску в кислом растворе с нитропруссидом [100]. Значительные количества метионина найдены в казеине. [c.38] Определение лизина. Другая основная аминокислота — лизин (XIV) — отделяется от остальных основных аминокислот осаждением пикриновой кислотой. Для определения лизина были также использованы метод изотопного разведения [61] и микробиологические методы Leu onosto mesenteroides или декарбоксилаза из бактерий) [106]. [c.39] Определение гистидина. Третья основная аминокислота — гистидин (XV) — отделяется от других оснований в виде серебряной соли. Реакция гистидина с диазобензолсульфокиелотой, дающая красное окрашивание, используется для его колориметрического определения [107]. [c.39] Определение тирозина. Растворимость тирозина (XX) в воде настолько мала, что он осаждается при нейтрализации белкового гидролизата. В связи с этим его можно определить методом изотопного разведения [61]. Различные цветные реакции тирозина также широко используются для его количественного определения. Наиболее часто применяются для этой цели 1) диазореакция — красное окрашивание, образуюшееся при реакции тирозина с диазобензолсульфокислотой [115, 116] 2) реакция Миллона — красное окрашивание, появляющееся в присутствии тирозина при прибавлении раствора ртути в азотной кислоте [117] 3) синее окрашивание, появляющееся в результате восстанавливающего действия тирозина на смесь фосфорновольфрамовой и фосфорно-мшибденовой кислот [118]. При обработке иодом в слабощелочном растворе тирозин иодируется. В результате иодирования получаются дииодтирозин и тироксин [119, 120]. Подобная же реакция наблюдается при обработке иодом белков [80]. [c.41] Вернуться к основной статье