ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Эффективные методы разделения продуктов деградации из "Установление первичной структуры нуклеиновых кислот" Продукты разных методов деградации наряду с физическими свойствами обычно различаются длиной цепи, составом и последовательностью оснований. Был разработан ряд весьма эффективных способов разделения смесей моно- и олигонуклеотидов по одному или нескольким из этих свойств. [c.47] Наиболее эффективными методами являются хроматография (колоночная, бумажная, тонкослойная), электрофорез (на бумаге, Б геле) и центрифугирование (в линейном градиенте плотности, при постоянной плотности). Обшая теория и экспериментальные детали хроматографии приведены в многочисленных книгах и обзорных статьях. Однако некоторые особенности этих методов следует специально отметить в ходе настоящего изложения, так как они служат неотъемлемыми частями многих подкодов к выяснению первичной структуры. [c.48] В случае природной нуклеиновой кислоты вследствие возрастающей сложности смеси разделение становится нечетким. [c.49] На рис. 2.3 и 2.4 приведены кривые элюирования при хроматографии продуктов ферментативного гидролиза РНК вируса табачной мозаики (РНК TMV). Можно заметить, что олигонуклеотиды из Ti -РНК-азного гидролизата (рис. 2.3), содержащие различные сочетания А, U и С с концевым G, разделяются хуже, чем олигонуклеотиды, полученные в результате гидролиза панкреатической РНК-азой и состоящие в основном из пуринов, оканчивающихся пиримидином (рис. 2.4). [c.50] Если повышение температуры вызывает главным образом плавление и увеличение степени связывания длинных олигонуклеотидов, то в случае более коротких олигонуклеотидов этот эффект должен быть меньше. Последнее должно расширить возможность дифференциации олигонуклеотидов по длине цепи. [c.54] В результате получается набор пятен, приведенный на рис. 2.9. Эта картина хорошо воспроизводится, и, как только состав пятна определен, последующая индентификация оказьгоается несложной. Для идентификации изомеров последовательности подобного разделения обычно бывает недостаточно, так как на бумаге они практически не разрешаются. [c.55] Во многих случаях мономеры, димеры и тримеры можно идентифицировать без деградации, просто по их положению на хроматограммах, по УФ-спектрам или спектрам дисперсии оптического вращения. Однако для более длинных олигонуклеотидов необходимо использовать методы, подобные описанным в настоящем разделе. [c.59] ЛИШЬ в том случае, если А является правым концевым звеном исходной цепи. Далее, поскольку один из этих фрагментов (ВА) содержится в наборе С, то именно С должно стоять слева от В А, откуда следует, что правый конец молекулы полимера имеет структуру С В А. Аналогичным образом, используя реагенты, расщепляющие цепь слева от специфических мономеров, можно установить структуру левого конца цепи. [c.62] Примечание дефисом обозначены фосфатные группы. [c.64] Далее можно рассмотреть перекрывающиеся последовательности в обоих наборах олигонуклеотидов. Так, U, один из необычных нуклеотидов, встречается в молекуле аланиновой тРНК только один раз (показано, что в действительности он представляет собой смесь U и hU). В панкреатическом гидролизате этот нуклеотид входит в состав G-G-G-A-G-A-G-U - (табл. 3,4), а в Ti-РНК-аз-ном гидролизате - в состав U - -U- - -G-(табл. 3.3), Эти два олигонуклеотида перекрьгоаются в положении и, отсюда следует объединенная структура G-G G-A G-A G-U - -U- - -G-. [c.65] Сопоставляя между собой олигонуклеотиды с перекрывающимися последовательностями из обоих наборов, можно получить объединенный набор, включающий все нуклеотидные остатки аланиновой тРНК (Holley et al., 1965). [c.65] Примером второго случая является перекрывание между панкреатическим олигомером 30 и -олигомером 18. [c.71] Набор всех перекрывающихся последовательностей в олигонуклеотидах из полного гидролизата фенилаланиновой тРНК приведен в табл. 3.9. Там же в каждом случае указано основание, предшествующее перекрывающейся последовательности. По аналогии с табл. 3.5 можно составить перечень перекрывающихся последовательностей, охватывающий все нуклеотидные остатки молекулы тРНК. Этот список включал бы 13 отдельных фрагментов, а также 3- и 5-конце-вые участки и демонстрировал бы возможные способы стыковки перекрывающихся последовательностей. Однако табл. 3.9 более удобна. [c.72] Вернуться к основной статье