ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Полный ферментативный гидролиз с папаином и аминопептидазой из "Твердофазный синтез пептидов" Реактивы. 1. Буферный раствор для инкубации с папаином — 0,05 М водный раствор ацетата аммония, pH 5,3. [c.125] Методика. Примерно 0,1 мг полипептидного субстрата высушивают на дне конической центрифужной пробирки, наливают в пробирку 85 мкл реактива 1 и 5 мкл реактива 3, доводя тем самым концентрацию меркаптоэтанола на период ферментативного гидролиза до 0,02 М. Затем к забуференному субстрату добавляют 10 мкл реактива 2 (5 мкг папаина), обеспечивая концентрацию папаина 50 мкг на 1 мл (весовое соотношение фермент субстрат 1 20) в объеме 100 мкл. Смесь инкубируют 2 час при 37°, затем инактивируют папаин 2 каплями уксусной кислоты, а раствор лиофилизуют. Вследствие небольшого объема раствора процесс лиофилизации заканчивается за 30—60 мин. [c.126] Частично лиофилизованную смесь растворяют в 80 мкл реактива 4 и 5 мкл реактива 3, добавляют к раствору 15 мкл реактива 5 (150 мкг АПМ) и тем самым доводят концентрацию АПМ до 1,5 мг на 1 мл (весовое соотношение фермент субстрат 1,5 1) з объеме 100 мкл. Инкубирование с АПМ ведут 3 час, понижают pH среды добавлением уксусной кислоты и смесь лиофилизуют. После этого остаток можно растворить в соответствуюшем объеме того буфера, который используют для введения образца в колонку аминокислотного анализатора. [c.126] Для полипептидов, включающих свыше 80—90 аминокислотных остатков (таких как рибонуклеаза), необходимо брать ббльшую концентрацию АПМ и вести ферментативный гидролиз в течение более длительного времени. Например, применяют 300 мкг АПМ в течение 3 час, затем добавляют еще 300 мкг фермента и продолжают инкубацию еще 3 час при этом получаются не менее удовлетворительные результаты, чем в случае более простых пептидов. [c.126] Количества аминокислот, образующихся в результате автолиза ферментов (определены в отдельном холостом опыте), не превышают 0,002 мкмоля (а для большинства аминокислотных остатков меньше 0,0005 мкмоля). В присутствии субстрата степень автолиза еще ниже. [c.127] Было показано, что этот метод особенно эффективен при количественном выделении аспарагина, глутамина, триптофана, цистина, трифторацетиллизина, моно- и дииодтирозинов и нитроаргинина, которые при кислотном гидролизе разлагаются или изменяются. В присутствии указанных количеств меркаптоэтанола метионин и сульфоксид метионина также сохраняются 8 первоначальном виде. [c.127] Вернуться к основной статье