ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Заболевания, связанные с нарушением метаболизма пиримидинов из "Биохимия человека Т.2" Технология рекомбинантных ДНК, чаще называемая генной инженерией, революционизировала биологию и оказала огромное влияние на клиническую медицину. До разработки методов рекомбинантных ДНК наследственные болезни человека изучали с помощью анализа родословных и исследуя аномальные белки. Однако во многих случаях, когда конкретный вид генетического повреждения установить не удается, эти подходы оказываются малоэффективными. Новая технология позволяет адресоваться за нужной информацией непосредственно к молекуле ДНК. В настоящей главе рассмотрены основные концепции, на которых базируется технология рекомбинантных ДНК, ее применение в клинической медицине. В конце главы помещен краткий словарь-справочник. [c.35] Разобраться в сути технологии рекомбинантных ДНК важно по нескольким причинам. [c.35] ДНК представляет собой биополимер сложной структуры, организованный в двойную спираль. Ее основными элементами являются пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (тимин и цитозин) основания. Эти основания присоединены к атому С-Г углевода (дезоксирибозы). Сами углеводные остатки соединены между собой по 3 - и 5 -положениям фосфодиэфирными связями (рис. 37.1). Чередующиеся остатки дезоксирибозы и фосфатные группы образуют остов двойной спирали (рис. 37.2). Направление связей 3 5 определяет ориентацию данной цепи, и, поскольку ориентации двух комплементарных цепей противоположны, их называют ан-типараллельными. [c.35] По температуре денатурации — ренатурации можно оценить степень комплементарности нуклеиновых оснований в цепях ДНК. Для денатурации сегментов ДНК, характеризующихся высоким уровнем комплементарности. требуются соответственно большие затраты энергии. Расхождение цепей таких фрагментов ДНК происходит соответственно при более высокой температуре. Это физическое явление используется на практике для определения степени сродства (гомологии) различных нуклеиновых кислот и лежит в основе метода гибридизации (одного из главных в генной инженерии). [c.36] Гаплоидный набор человека состоит примерно из 310 пар нуклеотидов (п. н.). Если размер гена в среднем равен 3000 п. н., то, допустив, что гены не перекрываются, а транскрипция идет лишь в одном направлении, можно вычислить, что геном человека включает до 10 различных генов. Считается, что их в геноме человека не более 10 и лишь 10% геномной ДНК непосредственно кодируют белки. О функциональном значении остальных 90% известно крайне мало. [c.36] Двойная спираль упакована в компактную структуру, образованную за счет взаимодействий с целым рядом белков (главным образом основного характера), называемых гистонами. Такая компактизация может выполнять регуляторные функции и имеет также определенный практический смысл . Дело в том, что ДНК ядра клетки при полном расплетании достигает длины 1 м. Хромосомные белки упаковывают гигантскую молекулу в ядро объемом всего лишь в несколько кубических микрон. [c.36] Основное направление передачи генетической информации реализуется в цепочке ДНКмРНКбелок (рис. 36.1, см. также гл. 41). Процесс этот жестко контролируется и состоит из ряда сложных этапов, каждый из которых регулируется одним или несколькими ферментами или факторами. Ошибка на любом этапе может приводить к заболеванию. [c.36] В основе методологии генной инженерии лежит выделение ДНК и проведение различных манипуляций с ее молекулами, включая получение химер (например, молекулы ДНК, построенной из фрагментов ДНК человека и бактерий). [c.36] А—аденин С—цитозин G—гуанин, 1 i имин. Стрелки указывают на сайты расщепления. В результате рестрикции могут формироваться липкие Ват HI) или тупые Нра I) концы. Длина узнаваемой последовательности варьирует и составляет 4 п. н. для Taq I, 5 п. н. для E o Rn, 6 п. н. для E o RI и 7 п. н. для Mst II. Согласно принятым правилам, верхняя цепь последовательности-мишени представлена в ориентации 5 - 3, а нижняя—в ориентации 3 - 5. Обратите внимание, что большинство последовательностей является палиндромами (т.е. читаются одинаково в противоположных направлениях по разным цепям). Остаток, обозначенный N, означает любой нуклеотид. [c.38] НЫМ образом, можно рассчитать частоту встречаемости участка узнавания для данной рестриктазы. В каждой нуклеотидной позиции молекулы ДНК с одинаковой вероятностью может оказаться один из 4-х нуклеотидов (А, С, С, Т). Поэтому фермент. [c.38] Ряд других ферментов, использующих ДНК в качестве субстрата, также имеет важное значение для генной инженерии. На некоторых из них мы остановимся в этой и последующих главах (табл. 36.2). [c.39] Понятие клон определяе гея как большая популяция идентичных молекул, бактерий или клеток— потомков одного предка. Клонирование позволяет получать большое количество идентичных молекул ДНК, которые можно охарактеризовать и использовать в каких-то целях. Метод клонирования основан на том факте, что химерные или гибридные молекулы ДНК могут быть сконструированы в составе векторов для клонирования, к которым относятся бактериальные плазмиды, фаги или космиды, способные к репликации в хозяйских клетках под контролем своих собственных регуляторных элементов. Таким путем добиваются амплификации химерной ДНК. Общая схема процесса клонирования представлена на рис. 36.3. [c.40] Фаги обычно содержат линейную ДНК, в которую могут быть встроены фрагменты чужеродной ДНК по какому-либо из доступных сайтов рестрикции. Химерную ДНК выделяют обычно после завершения рекомбинантным фагом литического цикла и выхода зрелых инфекционных фаговых частиц. Основным преимуществом фаговых векторов перед плазмидными является то, что в отличие от плазмид, способных нести фрагменты ДНК до 6—10 т. п. н., в фаговые частицы удается встраивать фрагменты размером до 10—20 т. п. н. Величина клонируемого фрагмента определяется общим количеством ДНК, способным упаковываться в головку фага. [c.40] Фрагменты еще большего размера могут быть клонированы в космидах—векторах, объединяющих преимущества плазмид и фагов. Космиды—это плазмиды, содержащие специфические участки, называемые со8-сайтами, которые необходимы для упаковки ДНК фага X в капсид. Эти вектора могут поддерживаться в бактериальной клетке в плазмид-ной форме, но так как большая часть ДНК фага из космиды удалена, то соответственно увеличивается и возможная длина клонируемого фрагмента. Довольно обычными для космид являются вставки размером 30—50 т. п. н. Свойства векторов трех типов сравниваются в табл. 36.3. [c.40] Вернуться к основной статье