ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методические приемы изоэлектрического фокусирования из "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" Больщи нство из перечисленных выще приемов пригодно как для аналитических, так и для препаративных целей. [c.131] При использовании градиента плотности для стабилизации зон в ходе ИЭФ можно применять те же или аналогичные приборы, которые предназначены для зонального электрофореза в градиенте плотности. Основная трудность при их конструировании состоит в том, что в процессе электролиза на электродах образуются пузырьки газа, мешающие нормальному разделению анализируемых веществ. Для преодоления этой трудности существуют два способа электроды пространственно отделяют от остальной части прибора или изготавливают их из специальных сплавов благородных металлов, на которых пузырьки газа не образуются. В этой главе будет описано несколько аппаратов обоих типов, употребляемых при ИЭФ. [c.131] Очень важно также, особенно в крупномасштабных препаративных опытах, обеспечить хорошее термостатирование колонок с градиентом плотности. Дело в том, что местные повышения температуры, возникающие из-за неодинаковой проводимости амфолитов, расположившихся в соответствии с их изоэлектрическими точками, могут изменить плотность отдельных слоев и тем самым поставить под угрозу стабильность всего градиента плотности. [c.131] Нижний конец колонки имеет форму конуса и непосредственно соединяется с выводящим капилляром. [c.132] Обычно для завершения ИЭФ достаточно 24—72 ч, после чего электродный клапан закрывают и содержимое колонки фракционируют через выводящий капилляр, не допуская смешивания полученных зон. Положение сфокусировавшихся белков можно регистрировать, измеряя. их поглощение в фотометре с проточной кюветой, соединенном с соответствующим самописцем. Величину pH отдельных зон, собранных вручную ИЛ1И с помощью. коллектора фракций, определяют на рН-метре. Поскольку изоэлектрические точки белков и окружающих их амфолитов должны быть одинаковыми, измеренная. величина pH каждой данной фракции соответствует изоэлектрической точке содержащегося в ней белка. При этом надежность полученных данных существенно зависит от объема фракций и чувствительности использованного рН-метра. [c.133] Теоретически не важно, находится ли в верхней части колонки катод или анод, однако на практике приходится иметь дело с факторами, зависящими от полярности электродов. [c.133] Некоторые белки имеют тенденцию выпадать в осадок при величинах pH, равных их изоэлектрическим точкам, особенно если на колонку. с градиентом плотности нанесены большие количества белка. Оседающий бело может перемешать слои, расположенные ниже уровня его образования. Поэтому в тех случаях, когда заранее. известно, что определенные компоненты белковой смеси выпадут в осадок, электроды следует расположить таким образом, чтобы изоэлектрическая точка белка с наименьшей растворимостью была ниже изоэлектрических точек других изучаемых белков. Иногда осаждение белков можно предотвратить добавлением таких веществ, как мочевина в концентрации 2—8 М [128, 627, 1183] или неионные детергенты (твии 80, эмасол, бри 39, тритон Х-100) в концентрации 0,1—0,5% [886, 1343, 1344]. [c.133] Осадок белка, образовавшийся в его изоэлектрической точке, как. правило, можно вновь растворить, если сдвинуть pH в ту область, где этот белок растворим [878, 1344]. В некоторых случаях добавление к белковой смеси тиоловы соединений в концентрации около 10 М также. препятствует денатурации и осаждению белков [1361]. [c.133] Упомянутые выше колонки фирмы LKB обладают большой емкостью. Даже меньшая из них имеет объем 110 мл и вполне пригодна для препаративных опытов, но не очень удобна, когда требуется разделить небольшие количества белка в аналитических целях. Поэтому было приложено много усилий по созданию аппарата для ИЭФ еще меньшего объема. [c.134] Остерман [948] описал колонку для ИЭФ, в прадиенте плотности с рабочим объе мом 12 мл. По конструкции она аналогична стандартным приборам фирмы LKB и, в то же время настолько проста, что может быть изготовлена в любой лаборатории. [c.134] Уэллер и др. [1402] предложили иную конструкцию U-об-разного аппарата, позволяющего разделять менее 5 мг белков в градиенте плотности объемом 11 мл. [c.135] Был описан еще один очень простой метод ИЭФ [709]. Стеклянные трубки с внутренним диаметром 0,6 см и длиной 20 см закрывают снизу диализной мембраной, заполняют раствором с градиентом концентрации сахарозы (40—10%), содержащим 1% амфолина, и помещают в аппарат для диок-элект-рофореза. Фокусирование заканчивается через 5—6 ч, после чего на верхнюю часть каждой трубки надевают конический тефлоновый колпачок, через который полученные фракции вытесняются вверх в результате накачивания в трубку снизу какого-либо раствора с высокой плотностью. Естественно, что при использовании такой методики также мож1но одновременно изучать несколько различных препаратов. [c.135] Свендсен [1254] сконструировал аппарат, в котором фракционирование содержимого колонки с градиентом плотности осуществляется при включенном электрическом поле. В этом аппарате нижний электрод отделен от колонки полупроницаемой мембраной и расположен в опециальном отсеке с подводящей и отводящей трубками, что позволяет прокачивать через него электролит из другого резервуара и таким образам удалять выделяющиеся при электролизе пузырьки газа. По окончании ИЭФ, не отклю чая напряжения, в пространство, находящееся непосредственно над полупроницаемой мембраной, насосом подают концентрированный раствор сахарозы. Одновременно вторым насосом из колонки откачивают жидкость через расположенную над мембраной выводную трубочку, причем скорость отсасывания содержимого колонки должна превышать скорость поступления раствора сахарозы. Благодаря такой разнице в производительности насосов образуется очень стабильная контактная поверхность раздела между поднимающимся снизу плотным раствором сахарозы и опускающейся сверху до уровня выводной трубки менее плотной жидкостью, заполняющей колонку. Описанная система полностью исключает перемешивание раздел ившихся белков, неизбежно происходящее в отсутствие электрического поля из-за наличия диффузии. Поэтому удается получить очень узкие зоны. К сожалению, pH собранных фракций сильно изменяется под влиянием раствора сахарозы, который может быть кислым или щелочным. Вследствие этого невозможно определить изоэлектрические точки выделенных белков. [c.139] В ряде работ описаны очень быстрые мнкрометоды ИЭФ, пригодные для разделения сего лишь 100 мкг белка в стандартных кварцевых кюветах, содержащих 1,5 мл раствора с градиентом плотности [401—404, 643, 1097]. Такие микрометоды позволяют проводить прямое спектрофотометрическое выявление и исследование отдельных белков. [c.141] Вернуться к основной статье