ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Исходные материалы из "Электрофорез и ультрацентрифугирование" Акриламид (СН2=СН—СОЫНг) представляет собой белый кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный препарат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный водный раствор должен иметь pH не ниже 5, а оптическая плотность 1%-ного раствора при 290 нм (Лгво) не должна превышать 0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих условиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воздействует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и растворять его следует в перчатках и под тягой. [c.7] КК -Метиленбисакриламид ( Био) — (СНг=СН—С0ЫН)2-СНг — используют В качбстве сшивки линейных полимеров акриламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02% акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке. В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия хранения и токсичность — такие же, как у акриламида. [c.8] Персульфат аммония в водном растворе постепенно разлагается, поэтому следует использовать только свежеприготовленные растворы. Сухой препарат хранится лучше, хотя и он медленно разлагается с выделением кислорода. Продажные препараты для электрофореза обычно достаточно хорошо очищены, но их следует проверять. Если 1%-ный раствор персульфата аммония в воде имеет рН 2, то он непригоден. Отметим попутно, что катион не играет роли в процессе инициации. Можно с успехом использовать, например, персульфат калия. [c.9] Рибофлавин представляет собой кристаллы в виде желтооранжевых игл. Он малорастворим в воде, но хорошо растворяется в слабощелочных водных буферах растворы имеют желто-зеленую окраску. [c.9] Рибофлавин также может служить инициатором полимеризации. При освещении его водного раствора видимым светом (445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лей-корибофлавина. Последний снова легко окисляется растворенным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет разложения перекиси продуцируются свободные радикалы (НО ), инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида. [c.9] К чистоте рибофлавина можно предъявлять не слишком строгие требования, так как он, являясь очень эффектибным инициатором, используется в гораздо меньших концентрациях ( 0,005%), чем персульфат аммония. [c.9] Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД)—(СНз) 2N—СНг—СНа— —К(СН ) — представляет собой бесцветную жидкость с плотностью 0,78 г/см . Концентрация неразбавленного ТЕМЕД — около 6,7 М. [c.9] ТЕМЕД не является, собственно говоря, инициатором полимеризации акриламида, но служит катализатором этого процесса, заметно ускоряя его протекание. Он эффективен только в своей неионизированной форме, поэтому при полимеризации ак-р,иламида в кислой среде содержание ТЕМЕД следует значительно увеличить. В нейтральной или щелочной средах ТЕМЕД можно вносить в количестве, эквимолярном по отношению к персульфату. [c.9] При подготовке определенной серии опытов удобно заранее приготовить концентрированный (30—40%) водный раствор акриламида и метиленбисакриламида с определенным соотношением обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточный раствор буфера, например 10-кратной концентрации. ТЕМЕД хранится хорошо, а персульфат аммония растворяют в воде непосредственно перед началом опыта. [c.10] Для приготовления геля маточные растворы мономеров и буфера смешивают в такой пропорции, чтобы получить нужную конечную концентрацию акриламида и буфера, дополняют до расчетного объема водой и вносят ТЕМЕД. После этого раствор деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и заливают в трубку или между стеклами для формирования пластин. При правильном выборе концентраций персульфата и ТЕМЕД полимеризация занимает 30—40 мин. Ее следует вести вдали от яркого источника света. [c.10] Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс. Наибольшую опасность для нормального протекания полимеризации акриламида представляет растворенный в воде кислород, молекула которого является определенного рода бирадикалом и потому способна оборвать цепную реакцию свободнорадикальной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов необходима именно для удаления из нее растворенного кислорода. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием— так, чтобы жидкость при пониженном давлении закипела, но как только интенсивное выделение пузырей газа закончится, деаэрацию следует прекратить, не допуская заметного испарения воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при комнатной температуре. [c.10] Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может помешать полимеризации, поэтому на поверхность раствора осторожно наслаивают до высоты 3—5 мм деаэрированную кипячением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке формы через иглу от шприца с помощью перистальтического насоса. Им же удобно отсосать воду после окончания полимеризации геля. Вначале граница между гелем и водой исчезает, но затем вновь появляется, что указывает на окончание процесса полимеризации. [c.10] Полимеризация—экзотермический процесс, поэтому в случае высокой концентрации акриламида во избежание образования пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо обеспечить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации увеличивается с ростом температуры за счет ускорения образования свободных радикалов. Этим можно воспользоваться для замедления полимеризации при охлаждении геля на 1 ее продолжительность увеличивается примерно на 2 мин. Полимеризацию гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести на холоду. [c.11] Гель получается наиболее однородным, если время полимеризации составляет 30—40 мин. Обычно этого добиваются эм--лирически, подбирая оптимальную концентрацию персульфата. Она может варьировать в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимости от концентрации акриламида и качества самого персульфата. С увеличением содержания акриламида концентрацию персульфата приходится уменьшать. Имеет смысл предварительно внести различные количества данного препарата персульфата в ряд пробирок с рабочим раствором мономеров акриламида, наблюдая продолжительность полимеризации в них. [c.11] Количество ТЕМЕД в объемных процентах можно брать примерно вдвое меньшим, чем персульфата. С учетом различия молекулярных масс и плотности ТЕМЕД это обеспечит их приблизительную эквимолярность. Напомним, что при использовании кислых буферов количество ТЕМЕД следует увеличивать вплоть до 10-кратного по сравнению с персульфатом. Впрочем, нередко вносят избыток ТЕМЕД и в нейтральные буферы. Существенной роли это не играет, если только гель не обнаруживает склонности к растрескиванию при высушивании (для ав торадйографии). В этом случае содержание ТЕМЕД надо снизить. [c.11] Весьма существенно обеспечить чистоту поверхности стеклянных форм для геля. Их тщательно моют лабораторными детергентами и обильно споласкивают водой. Трубки можно мыть щеточкой для курительной трубки. Неплохо дополнительно погру-, зить пластины или трубки на 1—2 ч в хромпик. Иногда их моют горячей азотной кислотой. По хорошо промытой стеклянной поверхности вода должна стекать, не оставляя капель. [c.12] ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концентрации акриламида (менее 5%). Это существенно для поддержания геля в устройствах с вертикальным расположением трубок или пластин. Кроме того, хорошее прилипание улучшает теплопередачу от геля к стеклу и уменьшает опасность образования шунтирующей ток пленки жидкости у поверхности стекла. Такой шунт, а иногда и канал, по которому вытекает буфер из верхнего электродного резервуара, может образоваться между боковыми торцами пластины геля и прокладками, определяющими его толщину, в случае загрязнения прокладок или неудачного выбора их материала. Прокладки из тефлона, плексигласа или чистой силиконовой резины не мешают полимеризации геля вблизи их поверхности. Однако некоторые сорта резины с наполнителями, а также смазки, которыми нередко герметизируют прокладки, могут препятствовать полимеризации. Смазку (лучше всего силиконовую) следует наносить тонким валиком из шприца со снятой иглой на таком расстоянии от внутреннего края прокладки, чтобы она не выдавливалась внутрь формы при ее сжатии пружинными зажимами (см. ниже). Для достаточно ровных стекол тефлоновые прокладки можно использовать без смазки. [c.12] Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько прочно связываться со стеклом, что их последующее извлечение из трубок или снятие стеклянных пластин с геля становится затруднительным. В этом случае можно силиконировать стекло или использовать формы, изготовленные из плексигласа, к которому ПААГ прилипает хуже, чем к стеклу, но при высокой концентрации акриламида — вполне надежно. Полимеризацию геля между тонким стеклом и толстой (для жесткости) пластиной плексигласа удобно проводить для последующего горизонтального электрофореза. После окончания полимеризации плексиглас можно легко снять, а гель на стекле перенести на охлаждающий столик прибора. Полимеризацию ПААГ для горизонтального электрофореза можно вести просто в тонком слое, налитом на строго горизонтальное стекло, если его поместить в кй ( ру, заполненную азотом. [c.12] Вернуться к основной статье