ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Фильтрация водных проб для химического анализа из "Мембранная фильтрация" Фильтрация водных проб перед их химическим анализом представляет собой самую распространенную процедуру в различных отраслях промышленности и в экологии. Фильтрацию, как правило, проводят для отделения нерастворимых компонентов от растворимых, чтобы иметь возможность подвергнуть анализу растворимую фракцию. Заметим, что слово растворимый не имеет особого химического смысла, но применяется в зависимости от конкретной цели фильтрации. Если растворимый относится только к низкомолекулярным компонентам, то должны быть использованы методы ультрафильтрации (см. гл. 13), но для общих целей водного анализа применяется фильтрация через мембраны и фильтры из стекловолокна, так что некоторые достаточно большие макромолекулы могут оказаться в растворимой фракции [2121. [c.326] Для определения наличия бактерий в водах, используемых в замкнутом производственном цикле, в метод мембранной фильтрации было внесено некоторое изменение, а именно мембраны окрашивались красителем Понсо-5, который связывается с белковым материалом. Индикация на микробную загрязненность воды устанавливается приблизительно по степени покраснения испытуемой мембраны. [c.327] Более общие способы контроля за содержанием частиц в водах, используемых для промышленных целей, состоят в количественном измерении скорости забивания- мембраны при пропускании- через нее воды. В одном способе воду пропускают через мембрану при постоянном давлении й измеряют скорость потока во времени уменьшение скорости потока пропорционально концентрации частнц. В другом способе воду фильтруют при постоянной скорости потока и следят за тем, как возрастает давление, необходимое для поддержания этой скорости. Полученное значение называют коэффициентом забивания. [c.328] В этой главе было описано использование мембранных фильтров в ряде отраслей биомедицины. Мы показали, что мембранные фильтры находят широкое применение в биомедицинских исследованиях как в своей обычной роли в качестве фильтрующих, так и в менее привычных ролях, а именно в качестве подложек при изучении белков и нуклеиновых кислот. Возможно, одна из наиболее широких областей применения мембранных фильтров связана с количественным определением радиоактивных веществ с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика, хотя в некоторых случаях, оказывается, лучше использовать стекловолоконные фильтры. Важным достижением в области молекулярной биологии стало применение мембран из нитроцеллюлозы для гибридизации нуклеиновых кислот. Без разработки методов гибридизации с помощью мембранных фильтров было бы значительно задержано развитие технологии рекомбинантных ДНК. [c.331] Вирусы намного меньше бактерий и в отсутствие адсорбции должны проходить через поры мембран, используемых обычно при фильтрации более крупных частиц. Мембраны, которые способны механически (стерически) задерживать вирусы, имеют размеры пор того же порядка, что и ультрафильтры. Однако при необходимости фильтрации больших объемов воды ультрафильтры забиваются слишком быстро, так что ими нельзя долго пользоваться. Для удаления вирусов из больших объемов, как, например, в случае проведения контроля по загрязнению воды, широко используются мембраны с порами бактериальных размеров. Несмотря на то что у этих мембран поры больше, чем размеры вирусных частиц, с их помощью можно выделять вирусы, которые адсорбируются на матрице мембраны. Действительно, поскольку толщина мембр,анных фильтров составляет примерно 5000 вирусных диаметров, они действуют по отношению к вирусам отчасти и как глубинные фильтры, хотя их эффективность по сравнению с истинными глубинными фильтрами довольно низка. Соответствующим подбором условий фильтрации, главным образом pH воды, можно увеличить задерживающую способность мембраны и удалить по существу все вирусные частицы из водной пробы, используя мембраны с размером пор порядка 0,45 мкм. Вирусные частицы, адсорбированные на мембране, могут быть затем десорбированы для их идентификации или подсчета. Применительно к вирусам мембранную фильтрацию наиболее часто используют при проведении анализа питьевой воды поэтому цель настоящей главы состоит в том, чтобы показать, как мембранная технология используется в этой области. Материал этой главы хорошо освещен в обзоре Биттона [29]. [c.333] Поскольку вирусы являются внитриклеточными паразитами, их нельзя обнаружить с помощью питательной среды, как это делается в случае бактерий. Для их обнаружения необходимо использовать культуру тканей с линией клеток, соответствующей данному вирусу. Главная трудность при выращивании вирусов в культурах ткани состоит в том, что присутствующие в пробе бактерии могут легко размножиться и уничтожить эту культуру. Поэтому, чтобы предотвратить разрастание бактерий, к питательной среде добавляют антибиотики. Методы выращивания вирусов на культуре ткани носят достаточно сложный и специальный характер, и в дальнейшем мы их не будем обсуждать, тем более, что в этой области нет недостатка в информации, которую при необходимости читатель может найти в соответствующей литературе. [c.334] Именно главным образом потому, что БГКП оказались ненадежными как индикаторы наличия вирусов в воде, и были разработаны методы прямого определения вирусов. Эти методы, описанные в 14-м и 15-м изданиях Стандартных методов проверки воды и сточных вод [3], все еще считаются предварительными они не имеют никакого юридического значения, и их следует рассматривать в основном лишь как средство для изучения патогенных вирусов в воде. [c.335] Помимо контроля источников воды на наличие вирусов существует и другая область, в которой необходимо применять фильтрацию для выделения вирусов из воды. Речь идет о приготовлении препаратов, не содержащих вирусов, например инъекционных растворов (см. гл. 7). Хотя вирусы не играют такой роли в заражении воды, как бактерии, для некоторых материалов или процессов удаление вирусов может стать необходи-, мым. Поэтому, даже независимо от проблемы загрязнений воды, очень важно представлять себе, как мембраны и микро- фильтры удаляют вирусы из воды. [c.335] Если не считать первого, ни один из этих методов не подходит для анализа очень больших объемов воды. Ультрафильтрация страдает от быстрого забивания мембран, методы осаждения недостаточно эффективны при низких концентрациях вирусов, а гидроэкстракцию можно использовать лишь при работе с малыми объемами. Мембранная фильтрация либо сама по себе, либо в сочетании с глубинными фильтрами, импрегни-рованными полимерами, представляет собой один из наиболее пригодных методов концентрирования вирусов. [c.336] Мы часто отмечали, что фильтры п мембраны адсорбируют макромолекулы и частицы, много меньшие, чем номинальный размер пор. В гл. II мы рассмотрели применение нитроцеллюлозных мембран для адсорбции белков и нуклеиновых кислот. Одна из основных проблем при использовании мембран, калиброванных по размеру пор, для определения размеров вирусных частиц заключается в том, что во многих случаях вирусы не могут пройти через мембрану из-за адсорбции, даже когда размеры пор много больше размера вируса. Подобная адсорбция бактерий на мембранных фильтрах рассматривалась нами в разд. 11.6. [c.336] Для второй стадии фильтрации рекомендуется использовать дисковые фильтры из стекловолокна с асбестом и эпоксидной смолой (размер пор 5,0, 1,0 и 0,45 мкм, диаметр 47 мм) производства фирмы Кокс инструмент дивижн . [c.338] Методики для концентрирования вирусов первоначально были проверены на полиовирусах. В этих опытах определенные небольшие количества полиовируса были добавлены к обычной питьевой воде, которая затем была обработана и подвергнута анализу. Якубовский и др. [116] использовали для первой стадии концентрирования фильтры фирмы Болстон , а на второй— дисковые фильтры фирмы Кокс после фильтрации 380 л водной пробы с низким содержанием вируса было достигнуто выделение около 50%. В табл. 12.1 приведены данные, полученные в нескольких разных экспериментах. [c.338] Приведено исходное содержание вирусов в 380 л воды. Фильтрация проводилась через трубки фирмы Болстон о порами 8 мкм. [c.339] СКИХ точек веществ, используемых при щелочной десорбции полиовирусов. При стандартном значении pH, равном 9, кислые аминокислоты и органические кислоты плохо подходят для десорбции, а лучше использовать нейтральные и основные аминокислоты. Кроме того, хорошими элюентами являются белковые растворы, такие, как мясной экстракт благодаря главным образом высокому содержанию в них нейтральных и основных аминокислот. [c.340] В заключение заметим, что Блок и др. [31] описали метод концентрирования полиовирусов с помощью мембран из альгината алюминия. Эти мембраны (см. разд. 3.8) обладают тем уникальным преимуществом, что, будучи растворимыми в водном цитрате натрия, не растворяются в воде. Таким образом, после того как водная проба была пропущена через мембрану, последнюю можно растворить в небольшом объеме раствора цитрата натрия, выделив в результате вирусный концентрат. Мембраны из альгината алюминия производит отделение фирмы Сарториус в Гёттингене (а не фирма Сарториус в США). Эти мембраны имеют низкую эффективность выделения и плохую воспроизводимость результатов однако выделение на них можно увеличить, если добавить в пробу хлористый алюминий до 0,0002 М. Кроме того, мембраны из альгината создают определенные трудности при обращении с ними, поскольку они ломкие, допускают лишь малые скорости фильтрации и могут эффективно использоваться только с пробами малых объемов. В настоящее время эти мембраны, по-видимому, не имеют преимуществ перед другими фильтрами, рассмотренными выше. [c.340] После фильтрации определенного объема пробы вирусы могут быть десорбированы. Это можно осуществить непосредственно в полевых условиях или в лаборатории, поскольку фильтр может быть стерильно извлечен и в охлажденном виде в стерильной упаковке доставлен в лабораторию. Десорбция может быть проведена либо 0,05 молярным глициновым буфером при pH 11,5, либо 3 %-ным мясным экстрактом при pH 9,0. Хотя глициновый буфер может десорбировать более эффективно, некоторые вирусы инактивируются при соответствующих этому буферу высоких значениях pH. Инактивацию вирусов можно свести к минимуму, если десорбцию проводить быстро. Десорбирующий раствор (около 1 л) помещают в сосуд, связанный с фильтрующим устройством, и пропускают жидкость через фильтр под давлением с такой скоростью, чтобы вся она прошла за 1—2 минуты. Элюат собирают в стерильный сосуд и, как только процесс десорбции будет закончен, доводят pH до 7,5—9,5, используя глициновый буфер с pH 1,5. Чтобы избежать инактивации вируса, всю операцию десорбции и нейтрализации следует завершить менее чем за 5 минут. [c.341] Более подробное описание рассмотренного выше метода и детали анализа на содержание вирусов читатель может найти в Стандартных методах Американской ассоциации здравоохранения [3]. [c.342] Вернуться к основной статье