ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Эписомные векторы генетической трансформации из "Генетическая инженерия" Кроме явных преимуществ ретровирусы как молекулярные векторы имеют и тот недостаток, что они относительно нестабильны генетически. По имеющимся оценкам, частота мутирования ретровирусов и их гибридных вариантов достигает 0,5 % в расчете на цикл репликации. Это связано, по-видимому, с низкой корректирующей активностью (или ее полным отсутствием) у ферментов ревертазы и РНК-полимеразы, реплицирующих вирусный геном. [c.408] У гибридных вирусов, в которых используется природный механизм сплайсинга вирусной РНК (см. 14.6.2), могзгг наблюдаться делеции в геноме, обусловленные аномальным сплайсингом. Таюе возможно, например, при случайном введении в гибридный геном последовательностей, узнаваемых как сайты сплайсинга (так называемые криптические сайты сплайсинга). [c.408] Учитывая неполноту наших знаний о факторах, влияющих на селекцию в клетке гибридных ретровирусов, важным элементом генно-инженерных работ следует считать анализ структуры генома (вплоть до секвенирования) отобранных после трансфекции вирусных клонов. Очень удобны для этих целей челночные векторы. [c.409] Можно ожидать, что вирусные препараты, полученные из культур — потомков индивидуальных инфицированных клеток, будут обладать большим генетическим единообразием, чем выделенные из трансфицированных клеток. Это связано с тем, что трансфицированные клетки часто несут множественные интегрированные копии экзогенной ДНК, причем некоторые из них могут подвергаться различного рода перестройкам и мутировать, и все они вносят вклад в состав вирусного препарата. Клетки же из инфицированных колоний содержат только индивидуальные копии провирусной ДНК. [c.409] Основное внимание ученых привлечено к кроветворным стволовым клеткам. Кровь содержит много типов клеток, выполняющих совершенно различные функции — от транспорта кислорода до выработки антител. Но все они происходят от одного и того же типа плюрипо-тентных стволовых клеток, которые в основном находятся в костном мозге. Важным дополнительным местом гемопоэза (кроветворения) является селезенка. [c.409] Отмеченные недостатки можно преодолеть, применяя в качестве трансдуцирующих векторов ретровирусы. В силу высокой эффективности инфицирования широкого спектра клеток ретровирусы обеспечивают наиболее подходящий метод интеграции чужеродных генов в хромосомы клеток. Инкубируя клетки костного мозга совместно с монослоем клеток упаковывающей линии, продуцирующей гибридный ретровирус, можно быть уверенным, что и без дополнительной селекции большинство клеток костного мозга, в том числе и стволовые клетки, будут инфицированы дефектным по репликации гибридным ретровирусом и ДНК-копия его генома будет интегрирована в хромосомную ДНК клетки. [c.410] Одну из первых работ такого рода выполнили Г. Келлер с соавторами (1985 г.). Гибридным ретровирусом N2 (рис. 14.45) инфицировали клетки костного мозга мыши, а затем вводили их облученным животным. Через разные промежутки времени из органов реконструированных мышей вьщеляли ДНК и анализировали ее на наличие гибридного провируса N2. Оказалось, что провирус выявляется в лимфоузлах, тимусе, селезенке и костном мозге экспериментальных животных в течение многих недель наблюдения. Более того, бьши проведены эксперименты, в которых костный мозг первичных реципиентов использовали для реконструирования вторичных реципиентов. В одном случае был показан перенос стволовых клеток, содержащих провирус N2, от животного к животному в четырех пассажах. [c.410] Идя от простого к сложному, исследователи прежде всего обратили внимание на ра аботку методов генотерапии ряда хорошо изученных моногенных заболеваний системы гемопоэза, таких как серповидно-клеточная анемия, З-талас-семия, синдром комбинированного иммунного дефицита (СКИД). Для лечения первых дв) заболеваний в организм необходимо ввести правильно функционирующий ген З-глобина, а последнего — ген аденозиндезаминазы. [c.410] Как видим, успешно решать задачи генотерапии можно лишь тогда, когда будет подробно изучена регуляция функционирования in vivo целевого гена, который предполагается ввести в организм реципиента. Кроме того, в идеале требуется метод, позволяющий удалять поврежденный ген и встраивать на его место полноценный. Но пока эта проблема не решена. [c.411] Эксперименты по трансдукции генов с помощью ретровирусных векторов проводятся не только на мышах. Так, С. Андерсон с соавторами в 1986 г. продемонстрировали возможность переноса гена аденозиндезаминазы человека в организм макака резуса с помощью гибридного ретровируса SAX (см. рис. 14.45 рис. 14.46). Традиционной предклинической моделью трансплантации костного мозга у человека является собака. Поэтому на данной модели также проводятся эксперименты по прижизненной трансдукции генов и получены первые положительные результаты. [c.411] В качестве клеток-мишеней для генотерапии также рассматриваются фибробласты кожи, эндотелиальные клетки кровеносных сосудов и др. [c.411] Хотя ретровирусы являются в настоящее время наиболее подходящими трансдуцирую-щими векторами для целей генотерапии, им присущи и некоторые недостатки. Во-первых, они интегрируют ДНК-копию своего генома в самые разные места хромосом клеток-мишеней, что может приводить к инактивации или нарушению регуляции различных генов. Преодолеть данное затруднение пока не уцается. [c.411] В целом следует отметить, что, несмотря на достигнутые несомненные успехи в разработке методов генотерапии, впереди экспериментаторов ждет множество проблем, связанных с реализацией модельных схем для генотерапии человека. Учитывая, что в настоящее время мировой наукой прилагаются огромные усилия к гоуче-нию генома человека и расшифровке молекулярных механизмов многочисленных наследственных заболеваний, можно надеяться, что в недалеком будущем многие проблемы удастся решить. [c.412] Браун Э. М. К., Скотт М. Р. Д. Ретровирусные векторы // Новое в клонировании ДНК. Методы / Под ред. Д. Гловера. М. Мир, 1989. С. 272-307. [c.413] Тотменин А. В., Гашников П. В., Щелкунов С. Н., Сандахчиев Л. С. Использование гена, ответственного за образование геморрагий, в качестве фенотипического маркера при создании гибридных вариантов вируса вакцины // Докл. АН СССР 1989. Т. 305. С. 1246-1248. [c.413] Вернуться к основной статье