ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы МЕТОД ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ из "Методы изучения митохондрий растений Полярография и электрофорез" Для полярографических работ применяется схема, состоящая из источника питания, ячейки и сопротивления, с которого снимается напряжение на самопишущий потенциометр (Рис. 7). [c.28] Чтобы предотвратить инактивацию, вызываемую отложением на катоде белков и других соединений, Кларком предложено покрывать катод полимерной пленкой, проницаемой только для газов. В настоящее время широко используется следующая конструкция полярографической ячейки (Рис. 8). В ячейке используется неподвижный платиновый электрод, отделенный от исследуемого раствора полимерной пленкой, проницаемой для кислорода (Руководство. 1973 Зеленский, 1986). [c.29] Термостатирование осуществляется потоком жидкости внутри ячейки, раствор перемешивается магнитной мешалкой, расположенной над пленкой, покрывающей электроды (Рис. 7). Рабочим катодом, на котором восстанавливается кислород является платина, а электродом сравнения - серебро (Рис. 8). Электроды совмещены в одном блоке из тефлона, который выполняет роль крышки и входит в ячейку как поршень. Объем ячейки 1,4 мл. Ячейки из плексигласа размещаются в гнездах термостатируемой камеры, находящейся на электромагнитной мешаже. Внутри ячеек располагаются магнитики, при помощи которых осуществляется перемешивание. Митохондрии вносятся в ячейку быстро через паз тефлонового блока. [c.29] Определение окислительного фосфорилирования чаще всего проводится по методу Чанса-Вильямса ( han e, Williams, 1956). Метод основан на том, что в отсутствии АДФ фосфорилирование не идет. Окисление же имеет определенную величину. При добавлении АДФ в инкубационную среду начинает идти фосфорилирование и происходит стимулирование окислительной активности митохондрий. Когда весь АДФ превратится в АТФ, окислительная активность снижается. Р/0 рассчитывается по отношению молярного количества добавленного АДФ к количеству стимулированного им поглощения кислорода (Р/0=АДФ/0). При определении окислительного фосфорилирования необходимо учитывать дыхательный контроль (ДК) - отношение скорости окисления в присутствии АДФ к скорости окисления после исчерпания АДФ (Estabrook, 1967). [c.30] Реакционная среда (среда инкубации), pH 7,4. [c.33] С целью стабилизации электрода и уменьшения дрейфа за 30 мин до начала опыта электрод выдерживается при рабочем напряжении (0,6-0,б5В) в бидистиллированной воде (вода наливается в ячейку) при той температуре, при которой проводятся измерения (обычно 2 С). Затем в ячейку наливается среда инкубации, вставляется электрод, включается мешалка и 10-15 мин электрод должен постоять. Затем ведется запись до полного отсутствия дрейфа. [c.34] Записываемая линия должна быть почти без наклона. После этого определяется предельный ток диффузии (линия разрыва в мм диаграммной ленты), соответствуюш ий объему кислорода, который растворяется в данном объеме при определенной температуре. Линия разрыва снимается не менее трех раз путем отведения одной из клемм электрода. При хорошей чувствительности полярографа линия разрыва обычно составляет 220-240 мм. [c.34] Отношение количества фосфорилированного АДФ к количеству утилизированного при этом кислорода рассчитывают следуюш им образом (Хохлова, 1988). На полярографической ленте измеряют (в мм) расстояние С, соответствуюш ее всему количеству поглош енного кислорода в состоянии 3 (от момента добавления АДФ до перехода в состояние 4). [c.36] Количество АДФ (мкМ). [c.36] Хохлова Л.Н. Выделение и изучение энергетических функций митохондрий растений Методические разработки. - Казань Изд-во Казанского университета, 1988. - 24С. [c.37] Вернуться к основной статье