ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Блоттинг из "Методы изучения митохондрий растений Полярография и электрофорез" Блоттинг - прием, заключающийся в переносе разделенных соединений из толщины геля на плоский носитель (ацетат целлюлозы, нитроцеллюлозу, бумагу, капрон, стевлянный фильтр). Различают следующие виды блоттинга 1) диффузионный (при наложении пленки с анализируемым ингредиентом он переходит на подложку в силу простой диффузии) 2) вакуумный (переносу помогает отрицательное давление, создаваемое под подложкой) 3) электрофоретический (образуется наложением тока перпендикулярно поверхности подложки). В настоящее время в основном используют электрофоретический блоттинг, соответствии с которым, гель, содержащий разделенные компоненты образца приводят в соприкосновение с мембраной, а затем прокладывают слоями фильтровальной бумаги. [c.62] При мокром блоттинге перенос проводится в пластмассовой емкости с буфером. Сэндвич из прокладок, геля и мембраны помещается вертикально между платиновыми электродами в емкости с буфером Towbin (25 тМ Трис, 193 тМ глицин, 20% метанол, 0.05 - 0.1 % ДДС-Na, рП 8.3). Данная система позволяет проводить быстрый и эффективный перенос белков на мембрану, но требует обязательного охлаждения буфера. [c.64] При полусухом блоттинге пористые проюгадки, гель и мембрана расположены между двумя горизонтально расположенными электродами. Полусухой блоттинг требует значительно меньшего объема буфера, чем мокрый , поскольку резервуарами ионов во время переноса служат пористые прокладки. [c.64] Выбор мембран определяется особенностями применяемой техники переноса белков, однако в настоящее время наибольшее распространение получили мембраны из нитроцеллюлозы. [c.64] Поскольку элюция ряда высокомолекулярных белков, а также плохо растворимых мембранных белков из геля после ДДС-Ма -электрофореза часто оказывается затруднена из-за их преьрпитации в геле под действием метанола, для улучшения переноса используют два приема либо из состава фера для переноса исключается метанол, либо в буфер вводится ДДС-Ма или другие детергенты. Исключение из буфера метанола позволяет улучшить перенос, но в то же время ухудшает связывание белков с нитроцеллюлозной мембраной. Введение же в буфер ДДС-Ма ухудшает связывание бежов с нитроцеллюлозной мембраной и увеличивает электропроводность буфера, что вызывает увеличение силы тока и тепловыделения в процессе переноса. В то же время ДДС-Ма не оказывает влияния на связывание белков с РУВР-мембранами и положительно заряженными мембранами из нейлона. [c.65] Выбор электрических параметров переноса определяется необходимостью достижения наивысшего напряжения поля при наименьшей силе тока, что связано с необходимостью минимизации вьщеления тепла в процессе переноса. [c.66] Блокирование мембраны проводится с целью предотвращения не специфического связьшания первичных антител. В случае недостаточной блокировки мембраны возможно появление высокого уровня фона на дальнейших ступенях обработки. Для блокировки нитроцеллюлозных мембран используются различные реагенты, в том числе 3% желатин, 5% обезжиренное сухое молоко, 1% БСА и Т ееп-20. Для блокировки положительно заряженных нейлоновых мембран обычно используется обезжиренное сухое молоко. [c.66] Первичные антитела могут использоваться как поликлональные, так и моноклональные. Полиююнальные антитела используют в разведении 1 1000 - 1 10 ООО. Моноклональные антитела используются в разведении от 1 100 до 1 1000, что объясняется тем, что они в каждом случае специфичны лишь к одной определенной детерминанте нативного белка, которая с определенной вероятностью может необратимо разрушаться в денатурируюш их условиях ЗВ3-электрофореза. [c.67] Вторичные антитела служат для выявления первичных антител, преципитировавших на специфичных для них белковых зонах. Вторичные антитела могут быть конъюгированы как с ферментами для последуюш его иммуноферментного анализа, так и с люминесцентными зондами или частицами коллоидного золота для непосредственной их визуализации. [c.67] Система щелочной фосфатазы имеет более высокую чувствительность. Растворимые субстраты системы, B IP и NET, образуют более прочные продукты реакции, не обесцвечивающиеся под действием света. [c.68] Альтернативой для систем проявления, использующих цветные продукты реакции, может служить система щелочной фосфатазы с хемолюменисцирующим субстратом, засвечивающим высокочувствительную фотопленку (Voyta et al., 1988). Данная система обладает очень высокой чувствительностью, позволяющей обнаруживать пикограммовые количества белка в менее чем за 15 минут. При этом она оптимизирована для получения очень низкого фона при использовании нейлоновой мембраны при стандартной процедуре переноса и блокировании мембраны обезжиренным сухим молоком. [c.68] Частицы золота прочно конъюгированные с вторичными антителами, белком А или белком О, связываются в комплексы антитело антиген и фиксируют розовое окрашивание золотых частиц на поверхности мембраны. Использование системы коллоидного золота позволяет избежать многих проблем, связанных с использованием окрашивающих субстратов, в том числе нестабильности результатов окрашивания в результате не специфических реакций и необходимости отказа от консервации сывороток азидом натрия. [c.69] Еще одно преимущество системы коллоидного золота в том, что чувствительность метода может быть повышена путем обработки серебром, адсорбирующимся на связанных с мембраной -золотых частицах. Розовые полосы, таким образом, превращаются в черные, повышая чувствительность обнаружения в пикофаммовой области. [c.69] Вернуться к основной статье