ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Электрофорез из "Государственная фармакопея СССР Вып.1" Электрофорез — метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к передвижению во внешнем электрическом поле. Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, основными из которых являются напряженность электрического поля, величина электрического заряда, скорость и размер частицы, вязкость, pH и температура среды, а также продолжительность электрофореза. При электрофорезе на носителях (твердая среда) на подвижность и эффективность разделения дополнительное влияние оказывают адсорбция, неоднородность вешества носителя и его ионообменные свойства, электроосмос и капиллярный эффект. [c.144] Существуют два различных метода электрофореза фронтальный электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде, и зональный электрофорез — в закрепленной среде (стабилизированная жидкость или носители). Они имеют единую аппаратурную схему источник тока, камеру для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока, и аппаратуру для сбора и идентификации разделенных веществ. Для электрофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофореза в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал ), так и наборы, составляемые экспериментатором из отдельных приборов (универсальный источник питания УИП-1, двухлучевой регистрирующий микрофотометр ИФО-451 и др.). [c.144] Электрофорез проводят в свободной незакрепленной среде в кювете, которая представляет собой разборный и-образный канал. В кювете создают четкую границу между исследуемой смесью веществ и буферным раствором. В процессе электрофореза первоначальная граница постепенно расходится на ряд границ по числу компонентов смеси. [c.145] Метод является единственным способом прямого определения абсолютной электрофоретической подвижности. Его применяют для веществ с высокой молекулярной массой, которые обладают слабой диффузией. [c.145] Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, роль которой состоит в стабилизации электрофоретических зон. В зависимости от среды и способа проведения зональный электрофорез имеет много вариантов. [c.145] Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез. [c.145] В обоих методах полностью исключена адсорбция, что позволяет обнаруживать и количественно оценивать вещества во фракциях непосредственно после электрофореза. [c.145] В качестве крупнопористых носителей применяют фильтровальную бумагу, крахмал, целлюлозу, порошкообразную пластмассу, агар-агар, ацетилцеллюлозу, стеклянный порошок. [c.146] Электрофорез в блоке. В качестве носителя используют крахмал, который формируют в виде блока, помещают на лоток, соединенный с двумя электродными сосудами, заполненными буферным раствором. Раствор исследуемого препарата замешивают на сухом крахмале и вносят в узкую поперечную траншею, сделанную в середине блока. После прекращения электрофореза блок разрезают на поперечные доли, из каждой элюируют и количественно определяют исследуемое вещество. Метод применяется для разделения веществ с молекулярной массой выше 30 ООО, так как вещества с меньшей молекулярной массой проникают и адсорбируются внутри крахмальных зерен. [c.146] Электрофорез на колонках. Колонку заполняют суспендированным в буфере носителем. Фракционируемую смесь отрицательно заряженных веществ (что имеет место для большинства биологических материалов) наносят в колонку сверху, а положительно заряженных — снизу. Сбор фракций после электрофореза осуществляют путем последовательного элюирования буферным раствором. [c.146] Электрофорез на проточных установках. Кювета проточной установки представляет собой полую стенку, которую заполняют носителем. Электрическое поле накладывают в поперечном направлении. В кювете создают равномерный ток буферного раствора сверху вниз. На верх кюветы в одно и то же место непрерывно подают тонкую струйку фракционируемого раствора. Под совместным влиянием электрического и гравитационного полей исходная смесь по мере спускания разделяется на расходящиеся веером компоненты. Со дна кюветы фракции собирают в серию пробирок. [c.146] Вариант этого метода на бумаге известен под названием вертикального электрофореза. [c.146] Электрофорез на бумаге. Вещество, подлежащее фракционированию, наносят на пропитанную проводящей жидкостью полоску фильтровальной бумаги на расстоянии не менее 1 см от края и не менее 2,5 см друг от друга. Бумагу подсушивают, помещают в камеру, концы погружают в кюветы с проводящей жидкостью. После пропитывания бумаги жидкостью к ее концам подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают в токе воздуха и оценивают результаты в соответствии с указаниями в статьях. [c.146] На мелкопористых носителях разделение веществ на зоны идет не только в соответствии с их электрическими зарядами, но и в зависимости от молекулярной массы и формы молекул. [c.147] Электрофорез в тонком слое проводится в закрепленном толщиной 1—2 мм слое силикагеля, агара, агарозы, крахмала, полиакриламидного геля, сефадекса, целлюлозы, кизельгура, окиси алюминия, алебастра. Проводящую жидкость вводят в слой носителя нли ею опрыскивают слой после его формирования. Раствор исследуемого вещества вносят на поверхность слоя или внутрь отверстий, вырезанных в слое. Электрофоретический процесс можно проводить в устройствах, предназначенных для электрофореза на бумаге. [c.147] Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5—6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3—0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двумерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках. Преимущество горизонтального варианта — простота исполнения, вертикального — большая разрешающая сила. [c.147] Электрофорез в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель (ПАГ) представляет собой синтетический продукт сополимеризации акриламида и сшивающего агента, чаще всего Ы, Ы -метиленбисакриламида. Благодаря образованию поперечных связей между растущими соседними полиакриламидными цепями, возникающими в результате полимеризации Бинильных групп, такой гель имеет структуру трехмерной сетки. В отличие от природного полимера крахмала синтетический гель прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям pH и температуры, нерастворим в большинстве растворителей и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос. [c.147] Электрофорез выполняют в установках вертикального или горизонтального типа. В ходе электрофореза необходимо следить за тем, чтобы кювета не перегревалась во избежание возникновения конвекционных токов. [c.148] Диск-электрофорез обычно проводят в узких стеклянных трубках, содержащих два разнопористых геля, Б ходе электрофореза в верхнем относительно более крупнопористом геле происходит концентрирование смеси, а в нижнем мелкопористом — ее разделение. Верхний и нижний гели готовят на различных буферных растворах, которые в свою очередь отличаются от буфера в электродных сосудах. [c.148] Вернуться к основной статье