Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English
Метаболическая перегрузка может привести к разнообразным изменениям в физиологии и функционировании хозяйской клетки. Одно из наиболее частых - снижение скорости роста клеток после введения чужеродной ДНК. Так, клетки, содержащие плазмиду, растут медленнее, чем нетрансформированные, не содержащие плазмид (табл. 6.6), что часто сопровождается утратой рекомбинантной плазмиды. Иногда метаболическая перегрузка приводит к тому, что под давлением отбора из плазмиды де-летируется рекомбинантный ген или его часть.

ПОИСК





Метаболическая перегрузка

из "Молекулярная биотехнология принципы и применение"

Метаболическая перегрузка может привести к разнообразным изменениям в физиологии и функционировании хозяйской клетки. Одно из наиболее частых - снижение скорости роста клеток после введения чужеродной ДНК. Так, клетки, содержащие плазмиду, растут медленнее, чем нетрансформированные, не содержащие плазмид (табл. 6.6), что часто сопровождается утратой рекомбинантной плазмиды. Иногда метаболическая перегрузка приводит к тому, что под давлением отбора из плазмиды де-летируется рекомбинантный ген или его часть. [c.127]
Плазмиды, обозначенные буквами А, В, С, D и Е, кодируют только р-лактамазу и имеют одинаковый размер. [c.128]
Поскольку клеткам, растущим в условиях метаболической перегрузки, не хватает энергии для нормального функционирования, затрагиваются прежде всего такие энергоемкие метаболические процессы, как фиксация азота или синтез белков. Могут изменяться также размер и форма клеток, образовываться слищком много внеклеточного полисахарида, склеивающего клетки друг с другом и затрудняющего микрофильтрацию. [c.128]
Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного количества чужеродного белка и нехваткой питательных веществ или строительных блоков — аминокислот, может произойти запуск стрессовых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеиназ, под действием которых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка. Истощение пула аминокислот может стать результатом эффективной экспрессии не только клонированных генов-мишеней, но и генов самого вектора, кодирующих маркеры устойчивости к антибиотикам. [c.128]
К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]
Чтобы получить какой-то белковый продукт, необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции в нужном сайте необходим промотор, а для ее остановки - терминирующий кодон. Клонированный ген часто бывает лишен таких сигнальных последовательностей, и для его экспрессии в прокариотической клетке-хозяине нужно обеспечить и то, и другое. Кроме того, поскольку для решения большинства биотехнологических задач белок должен образовываться в больших количествах, необходимо использовать промотор, который позволял бы получить высокий уровень транскрипции (сильный промотор) и распознавался РНК-полимеразой хозяйской клетки. Постоянная транскрипция клонированного гена истощает энергетические ресурсы хозяйской клетки, поэтому нужно использовать промоторы, работу которых можно регулировать либо с помощью специфических низкомолекулярных соединений, либо изменением температуры. [c.130]
Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]
Больщинство микроорганизмов, с помощью которых получают белковые продукты, растут только в присутствии кислорода. Последний плохо растворяется в воде, и при интенсивном росте его запасы быстро истощаются. Чтобы обойти эту трудность, использовали два пути 1) применяли штаммы, неспособные синтезировать некоторые протеолитические ферменты 2) включали в геном хозяйских клеток гены, кодирующие гемоглобин Vitreos illa sp., который связывает кислород окружающей среды и повышает его концентрацию в клетке. [c.130]
С увеличением числа копий клонированного гена увеличивается количество синтезируемого продукта. Однако при переходе к крупномасштабному производству конструкция плазмида/клонированная ДНК очень часто утрачивается. Чтобы избежать этого, разработали способы интеграции клонированного гена в хромосому организма-хозяина. Б этом случае ген остается в клетке как часть хозяйской ДНК. [c.130]
Системы экспрессии весьма разнообразны, и исследователям приходится каждый раз подбирать условия, наиболее подходящие для получения того или иного белка в том или ином организме-хозяине. И все же, несмотря на различия в деталях, для создания самых разных систем экспрессии используются одни и те же основные приемы. [c.131]


Вернуться к основной статье


© 2025 chem21.info Реклама на сайте