ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы ПРИГОТОВЛЕНИЕ, СОРБЕНТОВ И КОЛОНОК ДЛЯ ВЭЖХ из "Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография" Первоначально для разделения полимеров применяли различные промышленные силикагели. Изучен ряд силикателей, выпускаемых в СССР, и предложен набор из четырех марок (КСК-2 КСК-1 силохром СХ-1 и МСА-2500), перекрывающий диапазон молекулярных масс от 10 до 10 . Главный недостаток промышленных силикагелей заключается в плохой воспроизводимости их характеристик за счет весьма широких допусков, которые вполне допустимы при их использовании в технике. Кроме того, существенным затруднением является необходимость размола и выделения узких фракций с требуемым размерим частиц, как описано в разд. 5.1. Поэтому были разработаны силикагели, специально предназначенные для эксклюзионной хроматографии. Первым из таких сорбентов был лихросфер. Сферические частицы сорбента имеют большой удельный объем пор, хорошие механические свойства и позволяют получить колонки достаточно высокой эффективности. [c.107] Значительно лучшие результаты достигаются при использовании зорбакса Р8М, получаемого по особой технологии. Этот сорбент выпускают с тремя размерами пор, перекрывающих диапазон молекулярных масс от 10 до 2-10 . Для снижения адсорбции при работе в органических растворителях его поверхность силанизируют, а в водных системах используют не обработанный сорбент. Зорбакс Р8М характеризуется исключительной однородностью пор, что в сочетании с малым диаметром частиц и их умеренно узким распределением по размеру обеспечивает высокую эффективность колонок. [c.107] Пористые стекла в немодифицированном виде в последнее время применяют редко, так как они обладают значительно большей адсорбционной активностью, чем силикагель. Отличительной особенностью пористых стекол является чрезвычайно узкое распределение пор по размеру, поэтому они характеризуются очень высокой селективностью разделения, но в малом диапазоне молекулярных масс. [c.108] Качество получаемых сорбентов во многом определяется полнотой реакции. Теоретически в указанную реакцию может вступить примерно половина всех силанольных групп. Однако оставшиеся группы не могут взаимодействовать с сорбентами, так как экранируются глицерильными группами. При недостаточной степени покрытия полного экранирования не пооисходит и начинает проявляться силанольная активность незамещенных групп. Содержание таких активных групп, характеризующее уровень дезактивации сорбентов, часто оценивают по степени сохранения ферментативной активности лабильных ферментов после их пропускания через хроматографическую колонку. [c.108] Наилучшими свойствами для эксклюзионной хроматографии биополимеров обладают TSK-гели типа SW. Поверхность этих материалов покрыта гидрофильными ОН-грутопами по особой технологии, обеспечивающей исключительную инертность сорбента, практически не уступающую сефадексу. Поэтому эксклюзионное разделение, как правило, не осложняется побочными сорбционными процессами. TSK-гели SW выпускают с тремя размерами пор и они перекрывают диапазон молекулярных масс от 5 10 до 4 10 (по декстрану) или до 10 (по глобулярным белкам). За счет большого объема пор колонки, с этими гелями характеризуются высокой разделительной способностью, а их гарантированная эффективность составляет 16 тыс.т.т./м. Калибровочные кривые для некоторых модифицированных жестких сорбентов приведены на рис. 4.11. [c.109] Хотя подавляющее большинство разделений на жестких гелях с привитыми гидрофильными группами проводят в водных системах, эти материалы могут быть использованы и в сочетании с полярными органическими элюентами (тетрагидрофуран, диметилформамид, этанол), что расширяет возможности их применения. [c.109] Успехи, достигнутые за последние несколько лет при разработке сорбентов для высокоэффективной эксклюзионной хроматографии, позволяют предполагать, что в скором времени будут созданы новые материалы с еще более высокими характеристиками. [c.109] В ионообменной хроматографии применяют разнообразные сорбенты, используемые как для разделения белков, так и для разделения неорганических ионов и небольших молекул. Эти сорбенты можно разделить на при основных вида ионообменные смолы, пелликулярные материалы и силикагель с химически привитой фазой, обладающей ионообменными свойствами. Пелликулярные сорбенты в настоящее время практически не применяют, их используют лишь для заполнения предколонок и при воспроизведении старых методов. [c.110] Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы, как правило, являются сополимерами стирола и дивинилбензола, к которым привиты ионные функциональные группы. [c.110] Синтетические смолы являются гелями, каркас которых или матрица состоят из сети пространственно закрепленных между собой углеродных цепей. С матрицей жестко соединены фиксированные ионы, несущие заряд и придающие смоле свойства ионообменника. Сама матрица гидрофобна, а гидрофильные фиксированные ионы придают ей способность к набуханию, превращая смолу в полуэлектролит. Набухаемость смолы зависит от числа поперечных связей в молекуле или сшивки. [c.110] Твердость и механическая прочность сополимера стирола и дивинилбензола также зависит от степени сшивки, т. е. от процентного содержания дивинилбензола. Ионообменная смола с высокой степенью сшивки, содержащая 8—12% дивинилбензола, способна не изменять объем в различных растворителях и выдерживать большие давления без сжатия (усадки). [c.110] Обычно ионообменные смолы представляют собой микропористые сферические частицы диаметром менее 10 мкм. Сульфо-группы придают им способность к катионному обмену, а триалкиламмониевые — к анионному. Они обладают приемлемой эффективностью и высокой ионообменной емкостью. Емкость различных смол колеблется от 3 до 10 ммоль/г. [c.110] Эти материалы находят ограниченное применение из-за сравнительно низкой эффективности, что связано с очень медленной диффузией молекул образца в микропоры полимера. К достоинствам этих смол следует отнести стабильность и селективность. [c.110] Добиться высокой эффективности разделения удалось при использовании микрочастиц полностью пористого силикагеля, которому равномерно привита фаза, имеющая ионообменные группы. Силикагелевая основа делает материал более прочным. Проблемы набухания или усадки колонки редко возникают. Материал устойчив к любым буферным растворам, растворителям и высоким температурам (до 80 °С). Однако сильнокислотные или слабоосновные растворы (2 рН 7,5) могут привести разрушению силикагелевой основы. Как правило, эффективность, полученная на привитых ионообменниках, сравнима с эффективностью обращенно-фазных материалов одинакового зернения. [c.111] В силикагелях—материалах, доступных как образцу, так и противоиону, быстро устанавливается массопередача, что приводит к высокой эффективности колонки. Силикагели с привитыми группами делятся на микро- и макропористые в зависимости от диаметра внутренних пор. Микропористые материалы, имеющие небольшие по диаметру поры, позволяют молекулам растворителя, например воды, а также небольших ионов проникать в полимерную матрицу и задерживают большие молекулы. Большинство полимерных ионообменных силикагелей имеют микроструктуру. Полимерные смолы макропористого типа зачастую используют в жидкостной хроматографии низкого давления. Макропористые силикагели с привитыми ионообменными группами стали применять при разделении больших молекул, например белков. Однако устойчивость сорбента невелика из-за растворения его в водной подвижной фазе. Информация об ионообменниках привитых к силикагелю содержится в приложении 1.3. [c.111] Даже тот же сорбент, полученный от одного производителя, как и всякий сложный химический продукт, может в определенных пределах варьироваться по своим свойствам и хроматографическим качествам в зависимости от партии, времени выпуска и т.д. Часто фирмы, выпускающие сорбенты и заполненные ими колонки, используют для заполнения колонок сорбент улучшенного фракционного состава или просто более мелкий с целью убедить хроматографистов в невозможности полудня самодельных колонок со столь же высокими параметрами эффективности, симметрии пиков, проницаемости и т.д. [c.112] Следует принять за правило, что наилучшим путем для получения воспроизводимых результатов анализа является использование для заполнения колонок одного и того же сорбента, желательно одной партии. Технология упаковки колонок этим сорбентом также не должна изменяться. Если есть возможность получать готовые заполненные колонки, это существенно упрощает работу и позволяет сосредоточиться на самой хроматографии. То же относится и к использованию готовых сорбентов для ВЭЖХ. [c.112] Вернуться к основной статье