ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Отнесение резонансных линий из "ЯМР в медицине и биологии структура молекул, топография, спектроскопия in-vivo" Отнесение резонансных линий в спектрах ЯМР к определенным атомам в макромолекулах является одним из наиболее важных условий надежного определения молекулярной структуры. Хотя в принципе для получения определенной информации о структуре достаточно провести отнесение небольшого числа резонансных линий, точность структурной информации возрастает с увеличением числа расшифрованных линий, так как в этом случае можно провести дополнительное сравнение результатов. С ростом надежности расшифровки спектров существенно возрастает также и надежность следующих из этого выводов, которые часто весьма чувствительны к ошибкам, допущенным при отнесении резонансных линий. Расшифровка спектров ЯМР протеинов, как правило, проводится в две стадии сначала пытаются выяснить, какие резонансные линии относятся к аминокислотному остатку, и при этом не заботятся о том, какое положение занимает данная аминокислота в протеиновой последовательности. Таким образом во многих случаях выясняют, о какой из аминокислот идет речь. Второй шаг состоит в том, чтобы определить место этой аминокислоты в протеиновой последовательности. Как правило, эта проблема решается с помощью независимых, биохимических методов либо с использованием биохимического аминокислотного анализа, либо косвенным путем - по восстановлению соответствующей последовательности в ДНК. Поскольку такая расшифровка спектров предполагает определение параметров, характерных для каждой последовательности аминокислот, то очевидно, что эффективность расшифровки спектров зависит от того, насколько правильно определена эта первичная структура. Неточности, допущенные в определении первичной структуры, могут быть обнаружены в результате сравнения с данными, полученными методом ЯМР. Эта расшифровка основана на сравнении расстояний, которые являются типичными для аминокислот, следующих одна за другой в последовательности. Одновременно соотношения между расстояниями используются для упорядочения элементов вторичной структуры, так что при таком последовательном отнесении резонансных линий можно получить информацию о вторичной структуре. [c.128] Эта проблема может быть решена также при выделении исследуемых протеинов на культуре ткани и на клонах бактерий. К этому следует также добавить, что можно было бы подобрать условия, при которых бактерии будут продуцировать именно тот протеин, который необходим. Это, конечно, существенно повышает эффективность использования дорогостоящей дейтерированной аминокислоты. [c.131] В принципе для отнесения всех резонансных линий не существует более элегантного метода, чем методы двумерного ЯМР. Однако эффективность этого метода существенно понижается с ростом молекулярной массы. [c.132] Вторая проблема связана с перекрыванием искомого кросс-пика с другими сигналами, что не позволяет провести однозначное отнесение соответствующих сигналов в спектре. Решение этой проблемы может быть найдено при использовании других методов двумерной спектроскопии. Если же, например, вследствие перекрывания сигналов невозможно провести отнесение кросс-пиков в спектре, полученном с использованием метода OSY, по их принадлежности к соответствующей спиновой системе, то часто удается провести отнесение с использованием метода R T, так соответствующие картины кросс-пиков, полученные в этих двух экспериментах, различаются кросс-пики оказываются в разных местах спектра, и перекрывание отсутствует. [c.133] Наряду с уже известными биохимическими методами имеются другие методы, предназначенные для модификации боковых цепей молекул, что позволяет обнаружить корреляцию наблюдаемых изменений в спектрах аминокислот с изменениями, наблюдаемыми в последовательности. Эти методы в основном используют тот факт что, в нативном состоянии протеина реакционная способность аминокислот в зависимости от их положения в молекуле может различаться достаточно сильно. Это становится понятным, если представить, что аминокислота находится во внутренней части протеина, которая труднодоступна для взаимодействия с химическими веществами. В этом случае месторасположение модификации в последовательности может быть установлено с помощью химических методов. Распространены в основном методы H-D-обмена i-протонов гистидина или нитрование тирозина. Правда, все эти методы обладают тем недостатком, что здесь имеется опасность неверной интерпретации изменений, наблюдаемых в спектрах, в случае, если эти изменения возникают не в результате введения специфических меток, а, напротив, связаны с неспецифическими процессами денатурации. [c.134] Двумерная спектроскопия в данном случае является самым элегантным методом исследования. Если известно, какая из аминокислот анализируется, и где она расположена в последовательности, то можно охарактеризовать тип спиновой системы, соответствующей данному фрагменту, а для каждого типа подобрать наиболее подходящий метод. Если удается однозначно установить, какие из аминокислот (одна или несколько) расположены по соседству с данной аминокислотой и таким образом определить фрагмент последовательности, то можно провести согласование данного фрагмента с фрагментом в известной последовательности. Простейший вариант реализуется тогда, когда аминокислота встречается в протеине только один раз. В этом случае для определения последовательности отсутствует необходимость в получении данных о соседних аминокислотах. [c.134] Расстояния dNN и d M в последовательности зависят от диэдральных углов (ри1р основной цепи, причем по определению величины этих углов определяют вторичную структуру. Следовательно, величины, измеряемые при наблюдении ЯЭО, характеризуют вторичные структуры. [c.135] Вернуться к основной статье