ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы детекции биополимеров из "Биологическая химия" Как при выделении и очистке биополимеров, так и при проведении разнообразных исследований необходимо количественное определение содержания биополимера в полученной фракции, в выделенном или исследуемом образце. Во введении к этой главе уже указывалось, что биохимические исследования проводятся, как правило, с очень небольшим количеством материала и поэтому требуют высокочувствительных методов детекции. Наиболее широко распространенные методы детекции основаны на измерении оптического поглощения (спектрофотометрия), радиоактивности (радиохимические методы) или свечения образцов (люминесцентные методы). [c.248] Наиболее широко распространены флуориметрическпе методы, основанные на измерении флуоресценции. При поглощении ультрафиолетового или видимого излучения молекулы переходят в электронно-возбужденное состояние. Полученная энергия может полностью переходить в энергию теплового движения, а может с определенной вероятностью (квантовым выходом) испускаться в виде рассеянного электромагнитного излучения, как правило, с частотой, меньшей частоты возбуждающего излучения. Это рассеянное излучение называют флуоресценцией. Его интенсивность можно измерить с высокой чувствительностью в любом направлении, даже отличающемся от направления пучка возбуждающего излучения, лучше всего в перпендикулярном ему направлении. При использовании достаточно чувствительных фотоэлектронных умножителей это позволяет регистрировать концентрации флуорофоров, практически недоступные спектрофотометрическому методу. Для веществ с достаточно высоким квантовым выходом флуоресценции удается регистрировать концентрации флуорофора порядка 10 о М и ниже. [c.252] Использование флуорометрических методов ограничивается тем, что далеко не все поглощающие ультрафиолетовое излучение вещества являются достаточно эффективными флуорофорами. Тем не менее среди них находятся такие аминокислоты, как триптофан и тирозин, в результате чего флуоресцируют все содержащие их белки. При облучении светом длиной волны 280 нм, т.е. в максимуме поглощения остатков триптофана, наблюдается флуоресценция с максимумом испускания при 348 нм. [c.252] Сильным флуорофором является восстановленное никотинамидное кольцо, в результате чего интенсивной флуоресценцией обладает NADH, у которого максимум поглощения и максимум испускания находятся соответственно при 340 и 450 нм. [c.252] Это превращение используют в настоящее время при анализе аминокислотного состава белков вместо описанной выше обработки нингидрином. [c.253] Наконец, известны отдельные процессы испускания света, происходящие в живых организмах — светящихся бактериях и светляках. Это явление называют биолюминесценцией. Примером такой реакции является катализируемое люциферазой из светляков окисление люцифериладенилата (8) (см. 2.1). Поскольку образование люцифериладенилата требует участия АТФ, интенсивность свечения связана с количеством АТФ в образце. Это открывает возможность измерять количество АТФ в образце по уровню биолюминесценции с исключительно высокой чувствительностью (до 10 1 моль). [c.253] Можно также определить содержание пероксида водорода по интенсивности хемилюминесценции, возникающей в результате описанной выше реакции при добавлении люминола. [c.255] Процесс сопровождается существенным изменением потенциала, которое легко можно измерить и соотнести с концентрацией Н2О2. Следовательно, если подобный электрод обработать и глюкозооксидазой и пероксидазой вместе, то он будет отвечать на присутствие глюкозы, так как последняя будет окисляться кислородом, давая Н2О2 в соответствии с уравнением (1У.З). [c.256] Возможно использование и других типов физических ответов. Например, для реакций, сопровождающихся образованием или расходованием О2, могут быть сконструированы оптические биосенсоры. В качестве примера такого сенсора может служить концевая часть оптического волокна, покрытая двойной пленкой, состоящей из флуоресцирующего порфиринового красителя, заплавленного в полистирол, и соответствующей оксидазы, например глюкозооксидазы. По оптическому волокну к исследуемому образцу, в который погружен биосенсор, подвсн дится возбуждающее излучение и по нему же отводится к флуориметру испускаемое излучение. Интенсивность флуоресценции порфирина понижается в присутст ВИИ О2, и таким образом, может быть соотнесена с концентрацией О2 в слое, находящемся в непосредственном контакте с биосенсором. Расход О2, обусловленный присутствием окисляемого соединения, приводит к уменьшению концентрации О2 в слое, прилегающем к пленке, содержащей порфирин, воздействуя таким образом на интенсивность флуоресценций. [c.256] Вернуться к основной статье