ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Электрофоретические и хроматографические методы разделения и очистки белков и других биологических веществ из "Практикум по физической и коллоидной химии" В настоящее время прогресс биологической и медрг-цинской наук в значительной мере обязан развитию хроматографических и электрофоретических методов разделения и очистки биополимеров. [c.121] Разделение белков электрофоретическим методом. При всех значениях pH, за исключением ИЭТ, частицы белков, имея избыток положительных или отрицательных зарядов, в электрическом поле перемещаются к соответствующему полюсу. Скорость перемещения белка зависит, в первую очередь, от величины свободного заряда. Так как у разных белков при данном значении pH различные заряды и электрофоретические подвижности, то их можно разделить методом электрофореза. [c.121] Существует много электрофоретических методов. Наиболее эффективным из них является зональный электрофорез. При зональном электрфорезе смесь исследуемых веществ помещают в виде узкого слоя (зоны) на твердую поддерживающую пористую среду. В течение некоторого времени вещества с различной подвижностью разделяются на отдельные зоны и могут быть по отдельности извлечены или идентифицированы без извлечения. [c.121] Электрофорез сывороточных белков большей частью проводят в буферном растворе при pH 8,6. При этом значении pH белки сыворотки заряжены отрицательно и движутся к аноду. Так как изоэлектрическая точка сывороточного альбумина при рН 5, а -глобулина при рН 7, то при pH 8,6 наибольшей подвижностью обладает альбумин, а наименьшей -глобулин. Остальные белки имеют промежуточную подвижность. Путь, пройденный частицей данного белкового компонента, помимо заряда, зависит от времени, напряженности электрического поля, силы тока, от природы буферного раствора, его pH и ионной силы. [c.122] По окончании электрофореза полученные белковые зоны окрашивают красителем, связывающимся с белками. Расположение окрашенных полос дает качественную характеристику компонентов смеси, а по интенсивности окрашивания судят о количественном содержании. Количественное содержание белковых фракций можно также определить, элюируя белки с поддерживающей среды. [c.122] Разделение белков аминокислот и некоторых других биологических веществ хроматографическим методом. [c.123] Основные типы хроматографии распределительная, ионообменная и адсорбционная, В биохимических и медицинских исследованиях наиболее часто пользуются распределительной и ионообменной хроматографией. [c.123] Распределительная хроматография — метод, основанный на процессах распределения веществ, между двумя жидкими фазами. Одна из фаз представляет собой подвижный раствор, а другая жидкая фаза удерживается твердым носителем. Носителями неподвижной фазы могут быть силикагель, крахмал, целлюлоза, синтетические полимерные вещества. Распределительную хроматографию можно проводить в колонках, на бумаге, б тонких слоях пористых материалов, нанесенных на стеклянную поверхность. [c.123] Чем больше в молекуле данного вещества полярных групп, тем больше его сродство к водной фазе, тем меньше коэффициент распределения и меньше скорость передвижения по бумаге. Наоборот, вещество с большим количеством неполярных групп концентрируется, главным образом, в органической фазе и вместе с ней передвигается по бумаге. В бумажной хроматографии происходит многократное повторение акта распределения вещества между двумя фазами, причем каждый раз это происходит на новом участке бумаги. [c.123] Ионообменная хроматография на колонках с ионитами основана на обмене ионов данного вещества с подвижными ионами ионита. Для ионообменной хроматографии белков и других биологических веществ применяются синтетические ионообменные смолы и иониты на целлюлозной основе — целлюлозонониты. [c.124] ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА БУМАГЕ. [c.125] В сыворотке крови присутствует несколько десятков индивидуальных белков, которые разделяются на четыре основные группы альбумины а-, р- и 7 Глобулины. [c.125] Эти группы делятся, в свою очередь, на ряд фракций 1-, 2-, аз-глобулины и др. [c.125] Ребро стекла должно сразу коснуться бумаги по всей своей длине. Держат стекло в таком положении несколько секунд, пока жидкость впитывается в бумагу. Полоску бумаги кладут на рамку в камеру так, чтобы край с испытуемой жидкостью был у катода. Белки сыворотки при pH 8,6 будут передвигаться к аноду. В одну камеру кладут 5—6 полосок бумаги. Камеру закрывают и включают ток. Сила тока должна составлять 6—8 ма, напряжение — 150—160 в. Прибор оставляют включенным на 16—18 ч . [c.126] В отчет следует внести обоснование метода электрофоретического разделения белков, краткое описание работы, приложить полученную электрофореграмму и объяснить, какому белку отвечает каждая полученная окрашенная полоса. [c.126] По окончании электрофореза пластинку погружают на 30 мин в раствор метиленового синего в 5%-ном растворе уксусной кислоты. Окрашенные полоски отвечают белковым фракциям. [c.127] В отчете следует обосновать метод электрофореза и описать ход работы идентифицировать полученные белковые фракции и зарисовать вид электрофореграммы. [c.127] Не следует наносить на бумагу большие капли анализируемой смеси и отдельных свидетелей, так как при этом проявленные пятна аминокислот будут размытыми. Большая чувствительность метода требует чрезвычайной аккуратности в работе. [c.128] В отчете следует обосновать метод распределительной хроматографии на бумаге, описать ход работы, привести результаты, значения разделяемых аминокислот и зарисовать цветным карандашом вид полученной хроматограммы. [c.128] В отчете следует обосновать метод распределительной хроматографии на бумаге, описать ход работы и зарисовать полученную хроматограмму. [c.129] Вернуться к основной статье