ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Содержание томов из "Жидкостная колоночная хроматография том 3" Глава 24. Комплексные соединения полисахаридов с белками. [c.6] В отличие от многих природных соединений ферменты обладают тонкой структурой от других белков их отличает особая топография молекул, характерная для активной формы фермента. Высокоспецифическая структура нативного фермента способна легко нарушаться под воздействием внешних факторов. У некоторых ферментов нарушение четвертичной структуры часто влечет за собой потерю активности, причем иногда инактивация необратима. Более глубокие изменения, затрагивающие конформацию всей полипептидной цепи, ведут к денатурации. Известны случаи поверхностной денатурации при контакте фермента с некоторыми сорбентами, основной причиной которой является сильное гидрофобное взаимодействие. Возможность инактивации или денатурации следует всегда учитывать при разработке схемы выделения и фракционирования ферментов. [c.7] Конечно, не следует подвергать препараты ферментов воздействию высоких температур, кислот и щелочей, окислителей и восстановителей, детергентов или органических растворителей. Однако, работая с ферментами, можно не заметить небольших конформационных изменений, которые, хотя и не приводят к потере активности, способны настолько модифицировать молекулу, что она потеряет всякое сходство с нативным ферментом. [c.7] В ряде случаев необходимо работать в особых-условиях. Так, некоторые ферментные системы приходится исследовать в отсутствие кислорода. К подобного рода работам относятся изучение гидрогеназ, ферментов метансинтезирующих бактерий, исследование окислительно-восстановительного катализа с участием ферментов, ферментных систем анаэробных бактерий и их мутантов и т. п. [c.8] Колоночная хроматография ферментов, чувствительных к кислороду воздуха, требует строго анаэробных условий. Прибор, схема которого приведена на рис. 36.1, позволяет проводить хроматографию гидрогеназ с выходом 90% [3]. Все емкости и соединительные шланги тщательно продувают инертным, газом (не содержащим кислорода), который вводят в систему через бутыль I. В атмосфере инертного газа идут набивка и промывание колонки, а также сбор и хранение полученных фракций. Эти операции нельзя проводить на обычном хроматографическом оборудовании, используя в качестве защиты от кислорода какой-либо восстановитель, введенный в буферный раствор. Такая методика дает очень низкие выходы исследуемого материала. [c.9] Систематические исследования такого рода рекомендуется проводить в специально оборудованной лаборатории, где все операции осуществляются в бескислородной среде. Устройство такой специализированной научной лаборатории детально описано в работе 4]. [c.9] Для выделения ферментов из материалов различного происхождения, их фракционирования и концентрирования разработано множество эффективных методов. К ним относятся кристаллизация [5—7], диализ, ультрафильтрация и концентрирование на полых волокнах (8—10], электрофорез [И—13, гл. 35], экстракция [14, 15], лиофилизация [16], преципитация и методы с использованием растворимых неионных полимеров [17, 18], зональное центрифугирование [19]. [c.9] Этот новейший метод нашел применение при выделении панкреатической рибонуклеазы цыпленка на фосфоцеллюлозе [35] и фруктозо-1,6-дифосфатазы печени кролика на карбоксиме-тилцеллюлозе [36]. Эффективность этого метода видна из следующего примера при очистке глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы путем элирования фермента с СМ-сефадекса 2 мМ раствором глюкозо-6-фосфата выход фермента составил 91%, а удельная активность увеличилась в 51 раз [37]. [c.10] В табл. 36.2 отражена роль колоночной хроматографии в исследовании основных классов ферментов. [c.13] Данные получены при обработке 760 мг клеток, считая на сухой вес. [c.14] Фракции 49—70 монсно диализовать и повторно хроматографировать на гидроксиапатите. При градиентном элюировании препарат получают с большим выходом, однако он обладает вдвое меньшей удельной активностью. [c.14] В результате достйгнута 1000-кратная очистка фермента, общий выход активного фермента составлял 8,6%. [c.16] Аффинная хроматография позволяет сократить число операций. Об эффективности этого метода свидетельствует 4000-кратная очистка дигидрофолатредуктазы из кожи млекопитающих, достигнутая всего за одну стадию [56]. [c.16] И ультрацентрифугирования свидетельствовали о гомогенности полученного ( ермента. [c.18] Тирозин — аминотрансферазу выделяли методом аффинной хроматографии на пиридоксаминфосфатагарозе (сефарозе 4В) [61]. Фермент элюировали, изменяя состав буферного раствора. Препарат, прошедший на этой стадии 125-кратную очистку, подвергали далее гель-фильтрации на сефадексе G-200. ь-Тирозин-2-оксоглутарат—аминотрансфераза была выделена в виде смеси нескольких изоферментов. [c.19] Вернуться к основной статье