ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Определение молекулярного веса белков из "Гель-хроматография" Эндрюс [49, 56, 74], очень подробно изучив поведение белков, показал, что область фракционирования гелей сефадекса распадается на две части (см. табл. 5). В основной части кривой (фиг. 34, стр. 163) линейная зависимость между объемом выхода и логарифмом молекулярного веса выполняется достаточно строго, в то время как при крайних значениях молекулярного веса прямая линия искривляется. С практической точки зрения необходимо, чтобы измеряемый молекулярный вес находился-по возможности в той области кривой, где зависимость линейна, В соответствии с этим сефадекс 0-100 целесообразно применять для анализа глобулярных белков с молекулярным весом от 10 000 до 150 000. Для сефадекса 0-200 эти пределы составляют соответственно 10 000— 300 000. [c.170] В последнее время все чаще выделяют белки, со- держащие помимо аминокислот углеводные фрагменты. Эти гликопротеиды обладают иной плотностью, чем чистые белки их поведение на колонках с гелями декстрана значительно отклоняется от нормы [54]. По-видимому, их молекулы имеют тем больший объем, чем выше в них содержание углеводов. Подробные исследования в этом направлении провели Эндрюс [49], а также Уорд и Эр-нотт [75]. [c.170] Как известно, конформацию белковой молекулы можно нарушить посредством какого-либо внешнего воздействия. Такое нарушение ведет к увеличению объема молекулы, что проявляется в снижении объема выхода. Так, диаграмма элюирования сывороточного альбумина на сефадексе 0-200 мочевиной (5 М) содержит два пика, тогда как обычно его /Саг) = 0,43. Первый компонент элюируется гораздо раньше (/Са = 0,1) около 60% белка не претерпевает никаких изменений [76]. Вполне возможно, что часть молекул денатурировалась и занимает поэтому больший объем. По изменению объема выхода можно непосредственно проследить за различными стадиями денатурации белка [77]. Так, молекулярный вес рибонуклеазы, установленный на сефадексе 0-100, увеличивается после денатурации щелочью в 1,9 раза, после окисления надмуравьиной кислотой — в 3,0 раза, после обработки 4 М мочевиной — в 2,5 раза, а после обработки 8 М мочевиной — в 4,3 раза. Как можно убедиться с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-200 [160], химическая модификация сывороточного альбумина (ацилирование различными реагентами) приводит к весьма значительному увеличению объема. [c.171] Как уже отмечалось в гл. П1, на элюирование белков с геля в незначительной степени влияет температура [54, 78, 79]. Можно допустить, что в основе этого лежит изменение третичной структуры белков. С равным правом можно предположить, что это влияние обусловлено небольшими изменениями структуры геля, а это приводит затем к уменьшению объема выхода [78]. Аналогичным образом изменение объема выхода белков под влиянием pH может быть обусловлено либо изменением структуры геля, либо частичной денатурацией белков. [c.171] Благодаря своей специфической активности ферменты представляют особый интерес для исследователей, занимающихся химией белка. В настоящее время непрерывно открывают новые метаболические реакции, очищают и выделяют катализирующие их ферменты (гл. V). Методом гель-хроматографии можно определить молекулярный вес фермента, полученного в виде неочищенного препарата (или в очень небольших количествах), если имеется возможность определить объем выхода с помощью специфического теста. Таким путем легко подобрать необходимые условия для дальнейших этапов очистки. [c.174] В табл. 26 перечислены 29 ферментов, молекулярный вес которых был установлен с помощью гель-хроматографии. Расхождения с данными, полученными с помощью методов, основанных на седиментации и диффузии, в большинстве случаев очень незначительны. [c.174] Метод геЛь-хроматографии действительно очень прост в осуществлении и требует незначительных затрат однако не следует делать поспешные выводы на основании нестрого проведенного эксперимента. [c.174] например, оказывается, что единственный белок, который попадает на калибровочную кривую, — это именно лактатдегидрогеназа, молекулярный вес которой (135000) все еще твердо не установлен, то трудно понять, почему тем не менее молекулярный вес двух фосфатаз из матки крысы (232 000 и 197 000) может быть определен столь точно [94]. Точно так же если ближайшая точка калибровочной кривой (глицеринальдегид-фосфат-дегидрогеназа, мол. вес 130 000) лежит далеко от исследуемого белка, например, 5 -рибонуклеотид-фосфогидролазы (мол. вес 237 ООО), то полученный результат, несомненно, требует дополнительного подтверждения [95]. [c.174] В конце главы (см . литературу, приложение IV) приведен ряд других р абот, касающихся определения молекулярного веса белков с помощью гель-хроматографии. Эти работы не были упомянуты в табл. 26, поскольку в них речь идет о плохо охарактеризованных ферментах или других белках. [c.175] Хроматографирование комплекса, полученного в опыте А с использованием элюента I (2 мл, 11,8%-ный раствор) на той же колонке в 0,1 М Na l, pH 7,0. Пунктирная линия — содержание ионов цинка (в мкг) в фракциях И. [c.177] Вернуться к основной статье