ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Неравновесные состояния белков и их релаксация из "Решаемые и нерешаемые проблемы биологической физики" Есть два главных метода получения металлсодержащих белков в неравновесных состояниях. [c.71] Для получения и сохранения неравновесных форм металлсодержащих белков и исследования их спектральных и магнитных свойств была разработана специальная техника низкотемпературного восстановления [38]. В этом методе содержащая металл простетическая группа восстанавливается в замороженном водном растворе при температуре жидкого азота с помощью радиолиза. При этом образуются термолизованные электроны. Исходные препараты представляют собой белки, активные центры которых могут существовать как в окисленной, так и в восстановленной формах. [c.71] После электронного восстановления активного центра возникают кинегачески стабилизированное неравновесное состояние. Атом металла в активном центре восстановлен, но его непосредственное окружение изменено настолько, насколько это позволяет замороженная в матрице и поэтому не изменившаяся глобула. Непосредственное окружение активного центра претерпевает колебательную релаксацию, но пространственная структура глобулы остается той же, какой она была в равновесном окисленном белке. Однако новое состояние активного центра и его ближайшего окружения должно в условиях равновесия соответствовать конформации всей белковой глобулы. Напряжение между измененным активным центром и остальными частями макромолекулы приводит к изменению спектральных и магнитных характеристик активного центра. Так возникает конформационно неравновесное состояние белка ион металла восстановлен, но структура большей части глобулы соответствует окисленному состоянию иона металла. Методы получения, фиксирования и исследования конформационно неравновесных состояний могут с успехом использоваться не только для отдельных белков, но и для внутриклеточных органелл, клеток и целых тканей. [c.71] С повышением температуры можно наблюдать релаксацию не ре-лаксировавшей части глобулы к новому равновесному состоянию. [c.71] Температура релаксации определяется природой белка и свойствами матрицы. [c.72] Скачкообразное добавление субстрата, ингибитора или другого специфического лиганда к равновесному белку, а также скачкообразное изменение pH или ионной силы. [c.72] Мышечные ткани содержат миоглобин, который, грубо говоря, является четвертушкой гемоглобина. Миоглобин имеет только одну субъединицу, структура которой идентична структуре р субъединицы гемоглобина. Миоглобин связывает кислород значительно сильнее, чем гемоглобин, и служит кислородным депо при недостатке кислорода. [c.74] Обратимое присоединение кислорода (оксигенация), которое позволяет гемоглобину выполнять его основную функцию, обусловлено возможностью образования сильных пятой и шестой координационных связей и способностью переносить электрон к кислороду от гистидина, а не от железа, т.е. без окисления Ре (см. рис.4.8). [c.74] На рис. 4.9 представлена типичная 8-образная кривая оксигенации гемоглобина (кривая о) и гиперболическая кривая оксигенации миоглобииа (кривая Ь). Последняя соответствует более прочному связыванию кислорода активным центром миоглобииа. [c.74] В отличие от миоглобииа, гемоглобин на начальных стадиях оксигенации обладает низким сродством к кислороду, и равновесие в реакции (4.17) сдвинуто влево. Затем кривая становится круче и при высоких значениях РО2 достигает насыщения. Это типичный эффект кооперативности. [c.74] Активность многих ферментов скачкообразно изменяется от одного значения к другому под действием некоторых низкомолекулярных агентов, которые не принимают непосредственного участия в каталитическом акте [39]. [c.74] Конформационный переход Т- R включает не только изменение четвертичной структуры белковой глобулы. Релаксация затрагивает все части четырех субъединиц. Чтобы понять последовательность событий в ходе релаксационного процесса, рассмотрим основные физические характеристики трех главных форм гемоглобина. Они приведены на рис. 4.11. [c.75] В равновесном гемоглобине ион железа (Fe +) лежит вне порфиринового кольца (примерно на 1 Л). Он имеет четыре электрона и магнитный момент, равный 5,5 Боровских магнетонов. Оптический спектр поглощения имеет широкую полосу с = 5,56 нм. В равновесном оксигемоглобине ион железа (Fe +) находится точно в плоскости порфиринового кольца, все электроны спарены (оксигемоглобин диамагнитен). В спектре оптического поглощения видны две характеристические полосы при 542 и 576 нм. В ферригемоглобине (метгемоглобин) при нейтральных значениях pH молекула кислорода замешается молекулой воды, не связанной химически с ионом железа (Fe ). Ион железа лежит значительно ближе к порфириновому кольцу, чем в феррогемоглобине (почти в плоскости), имеет пять неспаренных электронов и магнитный момент равный 5,91 Боровских магнетона. Спектр поглощения в видимой области не имеет выраженных характеристических полос. [c.75] Структурные изменения в активном центре (вблизи гема) приводят также к значительным изменениям пространственной структуры всего белка. После присоединения кислорода (Т - К-переход), некоторые аминокислотные остатки сдвигаются на 7 А. Эти структурные изменения инициируются присоединением одной молекулы кислорода, а затем распространяются на всю белковую глобулу. Поэтому в равновесной смеси присутствуют только Т и К формы. [c.76] Рассмотрим последовательность во времени таких структурных изменений, используя в качестве примера быстрое электронное восстановление ферригемоглобина. [c.76] Прежде всего подведем итог и суммируем основные структурные характеристики равновесных форм главных производных гемоглобина. [c.76] Анализ этих данных говорит о том, что образование низко-спино-вых неравновесных форм феррогемоглобина и его комплексов, после низкотемпературного восстановления ферригемоглобина и его комплексов, обусловлено сохранением аксиальных лигандов в шестом координационном положении иона Ре . Это положение, по всей видимости, занято атомом азота в имидозольном остатке дистального гистидина. Диссоциация лиганда блокирована стерическими препятствиями белковых групп вокруг гема. [c.78] Вернуться к основной статье