ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Использование метода предельной поляризации из "Люминесцентный анализ" СЯ на усилитель, а затем уже на измерительный прибор. Чтобы перейти к усилителям переменного тока, отличающимся большей стабильностью в работе, пользуются различными методами модуляции интенсивности поляризованного светового потока [7]. Для этого на пути светового потока ставится вращающийся поляроид. Если свет поляризован, то интенсивность его будет периодически меняться, модулироваться, и глубина модуляции будет зависеть от степени поляризации. Этот переменный световой поток падает на приемник (например, фотоумножитель) и дает переменный ток, который затем усиливается и измеряется. [c.337] По измеренной глубине модуляции можно судить о степени поляризации света. Можно пользоваться также и методом компенсации. При большой чувствительности фотоумножителя и хорошем усилении установка может обладать высокой чувствительностью и точностью. В качестве модуляторов, кроме вращающегося поляроида, можно использовать и другие устройства, подробности и преимущества которых можно найти в специальных статьях [8, 9, 16]. [c.337] Как уже указывалось, поляризация флуоресценции раствора зависит от того, насколько за время между моментами возбуждения и излучения успевают повернуться молекулы вокруг своих осей вследствие хаотического вращательного движения. [c.337] Следовательно, поляризация определяется, с одной стороны, временем жизни возбужденного состояния т, а с другой — вязкостью и температурой раствора, объемом и формой молекул. Если среднее время вращательной релаксации молекул (т. е. среднее время поворота на 90°) равно или меньше т, то флуоресценция полностью деполяризована. Максимальная (предельная) поляризация имела бы место при полном отсутствии броуновского движения. [c.337] В пятидесятых годах Вебер [27] развил теорию и для случая молекул эллипсоидальной формы. Полученные им формулы значительно более громоздки. В работах, использующих предельную поляризацию, часто ограничиваются сферическо моделью. [c.337] Отсюда можно определить объем молекулы, если известно время жизни возбужденного состояния % (и, наоборот, зная у, можно найти т). Надо отметить, что в этих опытах интервал изменения температуры Т не должен захватывать области температурного тушения, так как последнее связано с изменением т и это должно отразиться на поляризации. В настоящее время имеются прямые, достаточно падежные и точные флуорометриче-ские методы измерения т (величина т в случае молекулярного свечения порядка 10 сек.) (см., например, [51]). Измеряя этими независимыми методами т, можно получать данные о молекулярных объемах. [c.338] В последние годы появился ряд работ, в которых метод предельной поляризации использован для решения различных научных и научно-прикладпых задач. Кратко остановимся на них. [c.338] Определенные таким способом значення v сопоставлены с данными, полученными по осмотическому давлению. Результаты совпадают с точностью— до 10%. Авторы считают, что предлагаемый метод определения размеров коллоидных частиц может быть использован для растворов весьма малой концентрации, где неприменимы осмометрические, вискози-метрические и нефелометрические методы. [c.339] Большой интерес представляют работы, появившиеся в последние годы, в которых метод поляризовапной флуоресценции применен к исследованию белков и других биологических и биохимических объектов. Среди них особого внимания заслуживают работы Вебера. В первой из них [27] проведены теоретические расчеты деполяризации люминесценции для случая эллипсоидальных молекул, у которых имеются три разных характеристических времени врап] ательной релаксации, соответствующих трем осям эллипсоида. Эти расчеты учитывают хаотичность ориентации излучающих осцилляторов относительно осей молекул. Последнее существенно во всех случаях, когда флуоресцируют молекулы, связанные с крупными нефлуоресцирующими частицами. Кроме этого, расчеты учитывают также и ту деполяризацию, которая обусловливается колебаниями осцилляторов в молекуле, а также возможность присутствия в растворе нескольких флуоресцирующих компонентов. [c.339] В работе тщательно проанализированы возможные экспериментальные ошибки и способы их устранения, в частности предложен оригинальный метод проверки градуировки компенсаторов. [c.339] Вебер пользовался в своих работах первым способом. [c.339] Присоединение флуоресцентной молекулы не должно вызывать значительного химического изменения протеиновой молекулы, а образующиеся комплексы и их флуоресценция долл ны быть стабильны в значительном интервале температур и pH. [c.339] В качестве флуоресцентного вещества, отвечающего поставленным требованиям, был выбран 1-диметил-аминонафталин-5-сульфонил-хлорид. [c.339] Поляризация флуоресценции комплексов была измерена Вебером в функции температуры, и по его формулам им были определены размерЬг и форма протеиновых молекул. Оказалось, что молекулы овальбумина близки к сферическим, а у серум-альбумина они представляют эллипсоиды с отношением осей 4 1. [c.339] В противоположность овальбумину поляризация серум-альбумина зависит от pH среды это связано, по-видимому, с наличием диссоциации. [c.340] Вебером исследовано также влияние на овальбумин температуры, кислот и других факторов. Наблюдаемое в ряде случаев увеличение времени релаксации вращения автор объясняет ассоциацией макромолекул, осуществляющейся, по-В1ЗДИмому, водородными связями. Не останавливаясь подробно на результатах этих работ, важных для биохимии, отметим только, что поляризационный метод оказался весьма плодотворным. [c.340] Опубликован и ряд других работ, в которых использована методика Вебера. Лоуренс [32] применил второй из указанных методов получения комплексов и с помощью его исследовал адсорбцию молекул различных флуоресцирующих соединений (производные 1- и 2-нафтиламина, производные акридина, флуоресцеина и родамина) на белковых молекулах. Из измерений поляризации и интенсивности люминесценции свободных и адсорбированных молекул красителей он определил относительное число связанных молекул и отсюда—константу диссоциации комплексов белок— краситель. Проведя сравнительные исследования на флуоресцирующих красителях с различной структурой, автор получил ряд сведений о механизме адсорбции молекул красителей на белковых молекулах. [c.340] Флуоресцирует один из компонентов, так как только один из них оказывается меченным 1-диметил-амино-нафталин-5-сульфонил-хлоридом. Автор расширил теорию на случай двухкомпонентной и многокомпонентной системы. Изучалось взаимодействие компонентов и образование ассоциатов. Установлено, что взаимодействие значительно, когда компоненты заряжены противоположно, и оно быстро уменьшается с увеличением ионной силы. [c.340] Вернуться к основной статье