ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Получение, строение и свойства ДНК из "Биохимия нуклеиновых кислот" ДНК представляет собой полимер, мономерными единицами которого являются дезоксирибонуклеозидмонофосфаты. В большинстве случаев ДНК имеют высокий молекулярный вес в пределах 10 —10 и даже выше. [c.63] Выбор того или иного метода для выделения ДНК в каждом конкретном случае определяется природой использованного биологического материала. С подробным описанием методов выделения ДНК из животных и растительных тканей и из бактерий можно познакомиться в другой работе [9]. При работе с микроорганизмами одним из наиболее подходящих является метод Мармура [10]. Он сводится к разрушению клеток, денатурации клеточных остатков и удалению РНК при помощи рибонуклеазы с последующим избирательным осаждением ДНК изопропанолом. С целью предотвращения загрязнения ДНК двувалентными ионами металлов и разрушения ее дезоксирибонуклеазой добавляют хелирующие агенты и додецилсульфат натрия. [c.63] Для хрохматографической очистки ДНК применяются колонки из фосфата кальция [И, 12], анионообменников из замещенной целлюлозы, например эктеола-целлюлозы [13, 14], ипи полиметакрилата магния (амберлит ШС-50) [15]. Колонки из метилированного альбумина могут быть использованы для разделения денатурированной нагреванием и нативной ДНК или даже двух ДНК с различным суммарным содержанием гуанина и цитозина [16].. [c.63] Разделение нативной и денатурированной ДНК осуществляется также при помощи метода противоточного распределения [8, 17] и при помощи нитроцеллюдозных мембран [18, 31]. Очистка и выделение ДНК с применением градиентного центрифугирования описаны ниже (стр. 6-5). [c.64] Методы определения молярных соотношений оснований в ДНК нри помощи гидролиза и хроматографии подробно рассмотрены Бендичем [9]. [c.64] Как видно из табл. 5, результаты анализа ряда ДНК свидетельствуют о том, что препараты ДНК, выделенные из организмов разных видов, очень различаются по относительному молярному содержанию различных нуклеотидов в то же время препараты ДНК, выделенные из различных органов и тканей одного и того же вида, весьма близки по составу нуклеотидов. [c.64] ДНК образует два основных класса тип АТ , характеризующийся избытком аденина и тимина, и более редко встречающийся тип ГЦ , в котором преобладают гуанин и цитозин. [c.65] В большинстве случаев в молекуле ДНК присутствуют только такие основания, как аденин, гуанин, цитозин и тимин, но в некоторых ДНК цитозин в ограниченной степени мон ет быть замещен 5-метилцитозином. Содержание этого основания особенно высоко в ДНК зародышей пшеницы. В некоторых штаммах бактериофагов цитозин замещен 5-оксиметилцитозином (стр. 157,158). [c.65] По мнению Доти [23], молекула ДНК имеет только два особенно характерных физических свойства — молекулярный вес (стр. 79) и состав, выраженный относительным соотношением пар А — Т и Г — Ц. Пара Г — Ц прочнее, чем А — Т, т. е. больше способствует стабильности спирали ДНК, как это будет показано несколько ниже (фиг. 26). Кроме того, как установлено методом дифференциального центрифугирования, пара Г — Ц в большей мере, чем А — Т, обусловливает высокую плотность ДНК. [c.65] При центрифугировании небольшого количества ДНК в концентрированном растворе хлористого цезия вскоре достигается равновесие. Действующие при этом противоположные процессы седиментации и диффузии приводят к установлению стабильного градиента концентраций хлористого цезия с непрерывным повышением плотности в центробеишом направлении. Макромолекулы ДНК сдвигаются под действием центробежной силы в зону, где плотность раствора равна собственной плотности ДНК. Этой тенденции противостоит процесс диффузии, в результате чего в условиях равновесия определенный вид ДНК оказывается сосредоточенным в узком слое. При наличии нескольких видов ДНК с различной плотностью каждый из них образует определенный слой в том месте, где плотность раствора хлористого цезия равна плотности данного вида ДНК. [c.65] Для выделения фракций ДНК, распределенных по разным слоям раствора с градиентом плотности, на дне центрифужной пробирки прокалывают очень маленькое отверстие и по каплям собирают вытекающий раствор (фиг. 8). Большинство препаратов бактериальных или вирусных ДНК локализуется в узких слоях, что указывает на гомогенность ДНК. В отличие от этого ДНК млекопитающих образуют широкие слои, что, по-ывдимому, обусловлено их значительной гетерогенностью. [c.65] На основании подобного рода измерений удалось установить, что относительное содержание Г + Ц в ДНК из самых различных источников носит следующий характер [24, 34]. [c.66] Как будет показано в ходе дальнейшего изложения (стр. 212), ферментативным путем можно получить синтетические полиде-зоксирибонуклеотиды, содержащие только аденин и тимин или только гуанин и цитозин. Существует и природный поли- д-(А—Т), встречающийся в качестве минорного компонента в ДНК некоторых крабов [32, 33]. [c.67] И 5 углеводного компонента. Участие этих групп в формировании межнуклеотидных связей подтверждается результатами электрометрического титрования, поскольку при титровании в области pH от 12,0 до 13,5 не обнаружено свободных гидроксильных групп сахара. При помощи такого рода титрования и химических анализов установлено также наличие четырех первичных фосфорильных групп, трех аминогрупп и двух гидроксильных групп пурина — пиримидина на каждые четыре атома фосфора. Эти данные, а также почти полное отсутствие вторичных фосфорильных диссоциаций согласуются с предположением Левина о том, что молекула ДНК имеет вид длинной неразветвленной цепи. Молекулу ДНК можно изобразить в виде полинуклеотидной цепи с фосфо-диэфирными связями между углеродами в положениях 3 и 5 (фиг. 24). Обработка препаратов ДНК соответствующими ферментами, действие которых рассматривается в следующей главе, приводит к распаду ДНК с образованием нуклеозид-З -фосфатов или нуклеозид-5 -фосфатов. [c.68] Отсутствие гидроксильных групп при С-2 делает невозможным образовапие циклического фосфата, в связи с чем щелочной гидролиз ДНК протекает иным путем, чем у РНК. Эта особенность используется для аналитического отделения РНК от ДНК. [c.68] Для изучения молекулярной структуры ДНК был широко использован рентгеноструктурный анализ. Исследования подобного рода были проведены впервые Астбери [35], позже Франклином и Гослингом [36] и наиболее обстоятельно Уилкинсом и сотр., 137-39]. [c.68] Как уже упоминалось (стр. 64), Чаргафф [19] подчеркивал, что в молекулах ДНК из разных источников содержание аденина равно содержанию тимина, а содержание гуанина — содержанию цитозина. Именно этот факт наиболее убедительно показывает, что молекула ДНК имеет вид двойной спирали. На фиг. 26 показано, каким образом основания могут быть расположены в пределах этой структуры. На рисунке видны водородные связи между аденином одной цепи и тимином другой, а также между гуанином одной цепи и цитозином другой (и наоборот). В соответствии с этим порядок расположения оснований в одной цепи автоматически определяет последовательность оснований во второй цепи, комплементарной первой. Эта закономерность является весьма существенным моментом в предложенной модели. Что касается последовательности пар оснований вдоль цепей, то она может варьировать без всяких ограничений. Пары оснований плоские и могут располагаться одна над другой подобно стопке тарелок. [c.69] Уилкинс с сотр. [41, 42] внесли небольшую поправку в отдельные детали предложенной Уотсоном и Криком модели, оставив, однако, основную концепцию без изменений. Схема новой модели структуры В изображена на фиг. 28. [c.71] Вернуться к основной статье