ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Гистохимия и цитохимия из "Биохимия нуклеиновых кислот" Два первых метода можно использовать для приблизительного измерения содержания нуклеиновых кислот в отдельных частях клетки, в частности в ядре. [c.117] Появление окраски в ходе реакции Фёльгена, несомненно, обусловлено присутствием ДНК. Однако точное объяснение механизма реакции все еще является вопросом спорным. Не изучены еще и многие особенности применения этой реакции для окрашивания гистологических препаратов. Так, например, на способность ткани к окрашиванию сильное влияние может оказывать состав используемого фиксатора [12]. [c.118] Фотометрические измерения интенсивности окрашивания, развивающегося в срезах тканей при реакции Фёльгена, послужили основой для количественного определения ДНК (стр. 123) [5, 13-19]. [c.118] Упрощенный кварцевый микроскоп подобного рода сконструирован Лавеном [22], в нем использованы микроскоп Кёлера с кварцевой спиральной резонансной ртутной лампой и фокусирование при помощи флуоресцирующего экрана. [c.119] НОВОЙ кислоты, срез изучаемой ткани помещается на кварцевую пластинку, обычно в каплю глицеринового масла. При фотографировании в ультрафиолетовых лучах богатые нуклеиновой кислотой части среза дают на позитивном отпечатке темные участки, выделяющиеся на более светлом фоне [23]. [c.120] Ультрафиолетовые лучи тех длин волн, которые используются при изучении нуклеиновых кислот, весьма токсичны для живых клеток. Выдерживание живых препаратов под микроскопом дольше чем в течение нескольких секунд вызывает необратимые повреждения [24]. [c.120] В качестве примера на фото 2 приведены полученные в ультрафиолетовом микроскопе микрофотографии печени крысы. [c.120] Нуклеиновые кислоты как вещества с сильными кислыми свойствами обладают сродством к основным красителям — толуиди-новому синему, целестиновому голубому, пиронину, метиловому зеленому. Участки тканевых срезов, легко воспринимающие такие основные красители, получили название базофильных. [c.120] Возможность изучения распределения нуклеиновых кислот в тканевых срезах при помощи фермента рибонуклеазы в сочетании с основными красителями, например красителем Унна — Панпенгейма, была впервые установлена Браше [26, 31] в 1940 г. В первых своих исследованиях он применял неочищенные препараты рибонуклеазы. В настоящее время принято пользоваться для этой цели только кристаллическими препаратами ферментов, свободными от примесей протеаз. [c.120] После этого срезы быстро промывают дистиллированной водой, дифференцируют в 95-градусном спирте в течение 5—10 мин и заключают. Применяется также окрашивание 2%-ным водным раствором толуидинового синего в течение 20 мин. [c.121] Аналогичный метод использования дезоксирибонуклеазы вместо рибонуклеазы применялся лишь немногими авторами. Этот метод позволяет удалять ДНК из хромосом [37, 41], ядер нервных клеток [28] и ткани печени [42, 43]. [c.122] Под действием дезоксирибонуклеазы хромосомы и клеточные ядра теряют вещество, поглощающее ультрафиолетовые лучи и окрашиваемое метиловым зеленым или целестиновым голубым, и теряют способность окрашиваться по Фёльгену [8]. Дезоксирибонуклеаза действует только на фиксированные препараты, но не на ядра свежей ткани [44]. [c.122] Обычно метод Браше (рибонуклеазную пробу) применяют в сочетании с окрашиванием ткани основными красками. Но этот метод с равным успехом можно использовать и в сочетании с микрофотографией [33]. Таким путем можно убедиться в том, что инкубирование ткани с рибонуклеазой приводит к удалению из цитоплазматических гранул клеток печени какого-то вещества, по-видимому РНК, поглощающего ультрафиолетовые лучи. [c.122] Для удаления РНК из тканевых срезов Поллистер и Рис [236] употребляют не рибонуклеазу, а 0,3 М раствор трихлоруксусной кислоты, в котором срезы выдерживаются при температуре 90 в течение 15 мин. Этот способ воздействия, основанный на аналитическом методе Шнейдера (стр. 100), не нарушает целостность клеточных структур в тканевых срезах или цитологических препаратах. Фотометрически определяют поглощение изучаемой структуры в лучах с длиной волны 254 ммп. Затем нуклеиновую кислоту удаляют горячей трихлоруксусной кислотой, после чего вновь измеряют поглощение. Разность в величинах поглощения соответствует поглощению, обусловленному присутствием нуклеиновой кислоты. Это позволяет рассчитать количество нуклеиновой кислоты. Удаление РНК из гистологических препаратов может быть достигнуто также обработкой их холодной хлорной кислотой [44—46], 0,1 н. раствором КОН ]47] илл горячей 1 н. НС1 [48]. [c.122] Цитохимическим методам определения нуклеиновых кислот посвящен ряд обзоров [3, 4, 39, 49—51]. [c.122] Вернуться к основной статье