ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Кинетика денатурации белков из "Химия полимеров" Образующаяся при реакции сложноэфирная связь гидролизуется легче, чем исходная пептидная связь. [c.703] Избирательность гидролиза белков имеет жизненно важное значение для определения последовательности аминокислотных звеньев в полипептидных цепях белков. Обзор некоторых ранних работ в этом направлении можно найти в статье Зангера . [c.703] Как уже упоминалось в гл. 7, многие белки (так называемые глобулярные белки) в твердом состоянии состоят из плотных, жестких, закрученных особым образом макромолекул. Некоторые из белков этого типа сохраняют подобную структуру и в водных растворах и, вероятно, обладают такой же структурой и в живых организмах, откуда они были выделены. Однако при нагревании и растворении в других (неводных) растворителях или в водных растворах, если pH далеко от изоэлектрической точки, конформация макромолекул белков этого класса может измениться. Некоторые примеры таких изменений были даны выше, например на стр. 584—589. [c.703] Такого рода изменения конформации называют денатурацией. Этот термин применим не только для глобулярных белков, но и для аналогичных реакций нуклеиновых кислот, вирусов, а также белков, макромолекулы которых в исходном состоянии имели палочкообразную форму, и т. д. Однако большинство работ в этом направлении было посвящено глобулярным белкам, денатурация которых и будет рассмотрена в настоящем разделе. [c.703] Кинетическое изучение таких реакций (если они протекают достаточно медленно) ставится с целью выяснить природу внутримолекулярных сил. Методы исследования денатурации сильно отличаются, например, от методов изучения полимеризации или поликонденсации, так как в этих двух случаях известны точные характеристики начального и конечного состояний и обычно можно постулировать вероятную кинетическую схему. Если результаты эксперимента не совпадают с тем, что предсказано теоретически, то обычно бывает достаточно немного видоизменить схему, а не отказаться от нее вообще. При денатурации белков ни начальное, ни конечное состояния не определены, и заранее предложить возможный механизм, как правило, не удается. Поэтому исследования денатурации белков обычно ведутся широким фронтом, путем изучения влияния самых различных факторов на скорость реакции, и по настоящее время ни одно из исследований не привело к выяснению достоверного детального механизма процесса. [c.704] Можно сформулировать несколько общих принципов, справедливых для всех реакций денатурации белков. [c.704] КИСЛОТ, но процесс происходит при меньших pH, и реакция необратима . Наконец, на рибонуклеазу кислоты не действуют совсем. [c.705] В следующем разделе будет подробно рассмотрена одна из реакций денатурации, а именно денатурация яичного альбумина мочевиной. Эта система является хорошим примером того, какие данные могут быть получены при изучении подобной реакции и какой механизм обычно выдвигается для объяснения полученных цанных. [c.705] Реакция яичного альбумина с мочевиной была подробно изучена Каузманом с сотрудниками Проводилось два типа измерений определялось оптическое вращение, связанное с упорядоченностью внутри макромолекул (например, с содержанием спиральных форм, см. раздел 6), и определялась вязкость, связанная с эффективным гидродинамическим объемом. Типичные экспериментальные кривые для реакции при 30° С в фосфатном буфере (рН=7—8) при разных концентрациях мочевины представлены на рис. 193 и 194. [c.705] С сотрудниками объясняют эти две стадии реакции следующим образом. [c.707] На первой стадии реакции идет разрушение элементов внутренней упорядоченности, что может быть интерпретировано как разрушение спиральной структуры макромолекулы (см. раздел 6). fzo Как и следует ожидать, такой процесс приводит к увеличению размеров макромолекул и частично может объяснить наблюдаемое увеличение характеристической вязкости. Опыты по изменению 11уд./с, результаты которых представлены на рис. [c.707] Следует заметить, что для окончательного доказательства того, что на первой стадии процесс протекает внутримолекулярно, а на второй путем агрегации макромолекул, необходимо использовать также третий метод, например метод рассеяния света, который позволяет получить непосредственные доказательства изменения молекулярного веса. [c.708] Сначала рассмотрим зависимость степени превращения от времени. Пусть [N1—концентрация нативного белка в момент времени I и [О]—концентрация денатурированного белка в предположении, что молекулярный вес при денатурации не меняется. [c.708] Уравнения (34-8) и (34-9) содержат такое количество произвольных параметров, что могут описать любую экспериментальную кривую. Для того чтобы можно было использовать эти уравнения для проверки правильности предложенного механизма, необходимо подставить в уравнение численные значения большинства констант, оставив минимально возможное количество неопределенных параметров. Для этого сделаем несколько разумных допущений. [c.713] В результате в формуле для описания влияния концентрации мочевины осталось четыре произвольных параметра п, К, а и Один из них, кд, может быть получен совершенно независимым способом. Для этого необходимо предположить, как было сделано Каузманом с сотрудниками, что конечные продукты термической денатурации и денатурации, катализируемой мочевиной, одинаковы. Тогда можно экстраполировать найденные для более высоких температур (в отсутствие мочевины) константы скорости термической денатурации [см. уравнение (34-16)] в область температур, при которых проводили опыты с мочевиной, и тем самым получить величину кд. [c.714] Как мы убедимся позже, величина достаточно мала, так что ш в основном определяется первым членом правой части уравнения (34-13). Поэтому наблюдаемое с ростом температуры уменьшение т (см. рис. 198) означает, что и произведение аК также уменьшается с ростом температуры. Величина т, конечно, зависит от концентрации мочевины. Тот факт, что экспериментальные точки, представленные на рис. 198, хорошо ложатся на прямые линии, указывает на постоянство значений т это следует объяснить узостью интервала концентраций мочевины, в котором проводились опыты при всех температурах. [c.714] Поскольку, как будет показано ниже, V мало, . [c.715] Как было упомянуто выще, для объяснения экспериментальной зависимости т от температуры необходимо принять, что с ростом температуры аК уменьшается. Согласно предложенной схеме, аК является характеристической константой, определяющей склонность молекул мочевины к присоединению к макромолекуле при образовании активированного комплекса перед денатурацией. Поэтому вполне разумно, что с повышением температуры эта величина уменьшается, так как обычно диссоциация таких комплексов с повышением температуры растет. [c.715] Температура влияет на скорость реакции, как это видно из рис. 196, необычным образом. При низких температурах с повышением температуры к быстро падает. Кажущаяся энергия активации Ед =ЯТ д пк дТ) примерно равна—28 000 тл/моль при О °С. При 20 °С к перестает зависеть от температуры, так что Еа равно 0. При более высоких температурах й возрастает с температурой, и Еа достигает значения +50 ООО кал моль. [c.715] Где —энергия активации по Аррениусу. [c.715] Вернуться к основной статье