ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Специальные методики из "Химия полимеров" Экспериментально все кинетические исследования, изложенные в предыдущих разделах, сводились к приготовлению подходящей гомогенной смеси реагентов и к определению через некоторый промежуток времени изменившегося состава этой смеси. При теоретическом анализе результатов предполагалось, что стационарное состояние реакции наступало до того, как проводились какие-либо измерения. [c.738] Эта процедура является, несомненно, наиболее широко используемым методом изучения кинетики реакций. Однако этот метод имеет свои недостатки, главным образом потому, что часто имеется несколько вероятных механизмов реакции, которые могли бы привести к одинаковому результату в стационарном состоянии. Примерами такого рода неопределенности, которая может возникнуть, служат две реакции, изучавшиеся в первых разделах настоящей главы. При изучении распада ДНК (раздел ЗЗв) были предложены три совершенно различных механизма для объяснения хода всей реакции. При изучении действия фумаразы (см. раздел 35), исходя из данных опыта, можно было получить ряд различных констант скоростей образования комплексов фермента с субстратом. [c.739] По этой причине часто применяются специальные методы, которые дают возможность наблюдать ход реакции более тонко. [c.739] В большинстве случаев при изучении кинетики поток жидкости останавливают, когда достигается максимум скорости. Это можно сделать, прекратив работу поршней. Более быструю остановку потока можно произвести останавливающим поршнем, находящимся в конце наблюдательной трубки (см. рис. 207), который автоматически останавливает поток, когда трубка заполнена. Вслед за остановкой потока можно в течение желаемого длительного времени производить измерения поглощения света или другие измерения. [c.740] Спектрофотометрия не является единственным методом, который можно использовать для определения состояния реакции в точке наблюдения. Можно пользоваться и другими методами, например, изучать выделение тепла с помощью термоэлементов, определять pH или окислительно-восстановительный потенциал, измеряемый при помощи подходящих электродов, пользоваться полярографией и т. д. Прибор может быть видоизменен для введения нескольких различных реагентов последовательно. [c.741] В недавней обзорной статье Рафтон и Чанс описали довольно подробно различные типы используемых приборов. Теоретические вопросы рассматриваются Чансом . Общий вопрос о быстро протекающих реакциях был предметом недавно проводившейся дискуссии в Фарадеевском обществе . [c.741] Наиболее полно проточный метод был использован Чансом при исследовании кинетики действия каталаз и пероксидаз. Эти ферменты являются восстановительными белками и катализируют восстановление перекиси. Будучи восстановителями, они поглощают видимый свет (см. раздел 5е). Их спектр поглощения чувствителен к изменениям состояния атома железа в восстановительном белке и к характеру ионов и молекул, которые могут быть присоединены к атому железа. Таким образом, следует ожидать, и это подтверждается опытом, что ферментативный процесс будет сопровождаться изменениями спектра, как описано в разделе 35, при этом ферменты превращаются в один или несколько комплексов с субстратом. [c.741] Мы назовем их Е51 и Е5ц, не вдаваясь пока в точное установление различий их молекулярного строения. [c.742] В опытах, результаты которых представлены рис. 208 и 209, использовалась Н2О2 с аскорбиновой кислотой в качестве восстановителя при избытке субстрата с тем, чтобы при установлении стационарного состояния реакции в системе не было бы свободного фермента Е. В стационарном состоянии реакции, как показано на рис. 209, весь фермент присутствует в виде Е5ц. [c.742] Полоса при 395 ммк показывает, что свободный фермент исчезает и что в течение периода превращения Е51вЕ5п других изменений не происходит. [c.743] Реакция (3) очень быстрая, что видно из полосы при 410 ммк на рис. 208. При этой длине волны Е и Е5ц имеют одинаковое поглощение, и поэтому полоса дает представление о количестве присутствующего ЕЗь Из рис. 208 видно, что первый промежуточный продукт существует только в течение очень короткого периода времени. [c.744] На рис. 209 представлены кинетические данные для этой же реакции при значительно более высоких концентрациях. В этих условиях реакции, описанные выше, к моменту прохождения потока через точку наблюдения, уже завершены, и, когда поток останавливается, весь фермент находится в виде формы Е5ц. Основная часть графика представляет стадию стационарного состояния реакции, и в течение этого периода полоса поглощения, которая является мерой относительной концентрации Е и Е5ц, остается неизменной. Изменение появляется только в конце реакции, когда весь субстрат уже использован. Это изменение ясно свидетельствует о появлении свободного фермента. [c.744] Константа скорости к определяется непосредственно по начальным характеристикам полосы при 395 ммк (из рис. 208). Начальные характеристики поглощения при этой длине волны определяются также и обратной реакцией с константой скорости к . Однако, по-видимому, 2 слишком мала для того, чтобы эта реакция могла бы значительно повлиять на рассматриваемую часть кривой поглощения, т. е. начальный ход кривой соответствует только значению /г , и можно принять, что 2=0. [c.745] Возможно, наиболее разительным отличием в действии пероксидазы и фумаразы явл5 стся то, что константы скоростей для пероксидазы не зависят от pH в широком интервале значений последних (вероятно, во всем интервале стабильности белка). Это, по-видимому, отражает то обстоятельство, что активным участком фермента является атом железа в восстановительной группе и что ни одна из ионогенных групп фермента непосредственно не вступает в реакцию. Это также означает, что ни в одной из стадий реакции не принимают участия ионы Н и ОН . Другим отличием является то, что пероксидаза менее специфична, чем фумараза. В схеме реакции роль АНа могут выполнять не только органические молекулы, но и неорганические ионы, такие, как НОг и J. Более того, можно использовать большой ряд перекисей алкилов. [c.746] Характерные особенности реакции с пероксидазой, которые рассматривались выше, не позволяют (опять в противоположность реакции с фумаразой) легко ответить на вопрос, почему для проведения катализа необходимо присутствие макромолекул. Эта проблема усложняется еще и тем, что для фермента каталазы , который, подобно пероксидазе, может катализировать реакции типа НООК+АНз КОН+А+НгО и который тоже представляет собой восстановительный белок, имеющий ту же валентность и тот же тип связи, что и пероксидаза (см. стр. 111), требуются другие восстанавливающие агенты, отличные от необходимых в случае пероксидазы. Более того, механизм этой реакции состоит из одной стадии с двухэлектронной передачей вместо двух последовательных стадий с одноэлектронной передачей . Вероятно, необходимой предпосылкой для более полного объяснения действия этих ферментов должно являться лучшее понимание строения железопорфириновых соединений. [c.746] Рассмотрим второй случай и ограничимся изучением обмена между атомами водорода и дейтерия в водном растворе, т. е. обмена, который может происходить, когда молекула, содержащая атомы водорода, будет помещена в среду 0,0 или когда молекула, содержащая атомы дейтерия, помещена в среду НаО. Основной принцип, по которому происходит этот обмен, состоит в том, что атомы, принадлежащие к кислотным или основным группам (т. е. атомы водорода или дейтерия, присоединенные к кислороду или азоту), обычно обмениваются весьма быстро, в то время как атомы водорода или дейтерия, присоединенные к углероду, обмениваются только при повышенных температурах. [c.747] Кислотные и основные группы могут и не иметь измеримых констант диссоциации в обычной области значений pH, но обмен происходит быстро. Так, для спиртов алифатического ряда при всех обычных условиях эксперимента равновесие —ОН 0 + + Н сдвинуто практически полностью влево, для амидов равновесие —СО—ЫНз СО—ЫНз-ЬН фактически целиком сдвинуто вправо, а равновесие СО—ЫНг O =NH+Н полностью влево. Однако эти равновесия являются динамическими реакция все время идет в обоих направлениях, и, таким образом, обмен происходит быстро. [c.747] В тяжелой воде как растворителе во всех кислотных и основных группах белкового фермента атомы Н заместятся атомами В. [c.747] Вернуться к основной статье