ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Определение порядка чередования аминокислот в цепи из "Введение в молекулярную биологию" Во-первых, узнаем число строк и отделим, если это возможно, отдельные строчки друг от друга. Теперь задача облегчена. Вместо всего текста мы будем поочередно анализировать каждую строку. Во-вторых, берем каждую строку и разбиваем ее на фрагменты — слова . Способ разделения строки не столь уже важен, существенно лишь то, чтобы мы могли стандартно воспроизводить этот эксперимент и чтобы фрагменты оказались не слишком большими и не слишком малыми. Положим, что все фрагменты строки перемешаны друг с другом в полном хаосе. Но мы располагаем техникой разделения для получения каждого из них в чистом виде. [c.21] После того как практически осуществлено это разделение, задача снова сводится к неизмеримо более простой. Мы должны прочесть каждый фрагмент — каждое слово (эти слова будут в большинстве своем бессмысленными, так как способ разделения строки никак не связан со смыслом текста). Чтобы изучить каждое слово мы разрабатываем различные методы узнавания . Можно разбить короткое слово на буквы и идентифицировать их, затем разработать реагент, который подвесить только к началу слова . Пометив начало и разбив снова фрагмент на отдельные буквы, мы узнаем, которая из букв является начальной. Затем мы аналогично исследуем конечную букву. Для слова из трех букв все выяснено. Если слово длиннее (5—6 букв), то мы расщепляем его на 2—3 субединицы и снова разделяем более короткие фрагменты и изучаем их в индивидуальном виде. В итоге, вложив достаточно труда, мы будем знать строение каждого фрагмента и сможем написать все слова , входящие в строчку, но мы не будем знать, в каком порядке их следует расставить. [c.21] Чтобы решить и эту проблему, приходится повторить разделение строчки на слова каким-либо независимым, вторым и третьим способом. Тем же путем, как рассказано выше, проводится идентификация всех слов в каждом с.иучае разделения строки. Имея 2—3 независимых способа разделения строки и изучив все получившиеся слова , можно попытаться восстановить весь текст строки. Иногда это оказывается легче, иногда труднее. Часто в той или иной области текста остаются неоднозначные решения. Тогда приходится искать новый способ разбивать соответствующий фрагмент строки. Логика этих приемов такова, что она в конце концов ненременно приводит к правильному решению. [c.21] Теперь рассмотрим конкретную химическую задачу. [c.21] Обычно первое, с чего начинают, — это установление числа полипентидных цепей в макромолекуле белка. Этот вопрос решается определением числа N-кoнцoв цепей или числа С-концов. [c.21] При этой реакции селективно отделяется концевое звено от К-конца полипептидной цепи. Это означает, что в принципе можно процесс продолжить дальше ступенчато, т. е. отделить следуюш ее концевое звено и т. д. Фепилтиогидантоины различных аминокислот хроматографируются на бумаге. Положения пятен локализуются либо с помош ью ультрафиолетового света, либо с помощью окрашивания иодом и сравниваются с положением свидетелей, приготовленных из известных аминокислот. [c.23] Оба метода определения числа К-копцов и исследования концевых аминокислот оказываются вполне удовлетворительными. Что касается измерения,,числа С-концов, то тут дело обстоит хуже. Один из практичных методов исследования С-конца — отщепление концевого звена с помощью чистого кристаллического фермента — панкреатической карбоксипептидазы. Этот фермент способен отщеплять постепенно по одному звену с С-конца поли-пептидной цепи. При этом некоторые аминокислоты им не атакуются (лизин, аргинин, пролин, оксипролин) поэтому этот метод не универсален, по все же чаще всего он применим. Отделив от конца цепи одно звено (путем кратковременного действия фермента), можно его выделить и идентифицировать с помощью бумажной или ионообменной хроматографии. [c.23] Решив задачу определения концевых звеньев в полипептид-ных цепях, мы тем самым узнаем и число цепей в макромолекуле белка. [c.24] На полипентидных цепочках появляются в результате окисления сильно кислотные группы — ЗОзН, которые диссоциируют полностью подобно серной кислоте. После разделения макромолекулы белка на отдельные полипентидные цепи, последние могут быть разфракционированы и получены в чистом виде. Так было сделано, например, с инсулином, состоящим из двух цепей А ш В. Разделение и очистка полипептидов осуществляется с помощью хроматографии на ионитах, в особенности на ионитах, приготовленных из целлюлозы. [c.24] При предельном гидролизе под действием трипсина пептидна цепь разрывается во всех доступных местах и нигде больше. В результате получается целая гамма полипептидов, обычно два—три десятка. Что характерно для триптического гидролизата, это его крайняя стандартность. При хорошей очистке исходного полипептида или белка, а также трипсина получаются всегда одни и те же фрагменты и в тех же количествах. [c.25] Теперь необходимо произвести полное разделение всех пептидов и получить каждый из них в чистом виде. Снова применяется хроматография на ионообменной смоле, на этот раз с слабокислотными, т. е. карбоксильными группами. Часть пептидов в триптическом гидролизате короткие — ди- и трипептиды. (Аминокислот трипсин не дает совершенно, так как это так называемая эндопептидаза, рвущая пептидную связь только, если рядом расположена другая пептидная связь, т. е. внутри цепочки. Все старые работы, в которых измерялось выделение аминокислот под действием трипсина, имели дело с грязной ферментной смесью). Но в гидролизате присутствуют и довольно длинные фрагменты, состоящие из 20—30 аминокислотных остатков. Все определяется расстановкой диаминокислот вдоль цени белка. [c.25] Поэтому после окончания разделения мы, не проявляя пятен, подвергаем их хроматографии в перпендикулярном направлении. Для этого картонный лист высушивается, и его край погружается в ванночку с элюирующей жидкостью (5 объемов нормального бутанола, 2 объема ледяной уксусной кислоты и 2 объема воды pH этой смеси близок к 3 смесь необходимо выдержать 2 недели, чтобы образовалось равновесное количество эфира). По мере движения элюирующей жидкости вдоль листа, на что (при размере листа 80x80 см) требуется около суток, происходит дополнительное разделение каждого электрофоретического пятна на несколько пятен. Хроматография на бумаге производит разделение не по различию зарядов, а по сродству пептидов к органическому растворителю. Те из них, которые лучше растворяются в смеси бутанол—уксусная кислота, бегут быстрее вместе с движением растворителя, т. е. имеют большие Rf. В итоге получается полное разделение триптического гидролизата на отдельные пептиды. [c.26] Я есть отпечатки пальцев . При соблюдении постоянства всех режимов и стандартности материалов картина отпечатков пальцев поразительно воспроизводима. Положения всех пятен на листе повторяются от опыта к опыту с точностью до 3—5 мм. Кроме того, проявление нингидринной окраски в мягких условиях приводит к химическому разрушению лишь небольшой части каждого пептида. Поэтому каждое пятно может быть вырезано и каждый пептид элюирован горячей водой и собран с минимальными потерями в виде отдельной фракции. [c.27] получив из одного большого фрагмента несколько меньших, производят их разделение и применяют метод концевых групп к каждому из них. [c.30] Исследование отпечатков пальцев белка не дает воз можности сразу же воспроизвести его структурную формулу. Трудность в том, что-, мы не знаем расположения отдельных полипептидов триптического гидролизата вдоль цепи. В дальнейшем будет показано, как с помощью-кинетического эксперимента удается перенумеровать отдельные пептиды и расставить их в должном порядке. Чисто химическим способом этого нельзя сделать, и потому приходится прибегать к получению второго независимого гидролизата того же белка с помощью второго фермента и к изучению второй независимой. гаммы -отпечатков пальцев. [c.30] Вернуться к основной статье