ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Рентгеноструктурный анализ белков из "Введение в молекулярную биологию" На модели видны пластина гема и положения, в которых присоединяются атомы ртути. Внизу слева — масштабная Л1шейка (в А). [c.89] ЭТОМ следует помнить, что анализ белков явился венцом в развитии самого метода и потребовал совершенно новых приемов, на изобретение и разработку которых ушло около 10 лет работы. Кроме ряда новых экспериментальных идей, в успехе рентгеноструктурного анализа сыграло большую роль развитие электронных счетно-решаюш,их машин. Работа по анализу структур требует огромного количества численных расчетов, главным образом суммирования рядов Фурье. [c.90] В итоге мы получаем рентгенограмму в виде системы пятен на пленке, геометрическое расположение которых связано определенным образом с геометрическим расположением атомов или ионов в кристаллической решетке. Если мы выбираем постоянный масштабный фактор — расстояние от кристалла до фотопленки (Ь), то положение каждого дифракционного пятна точно фиксировано в пространстве относительно серии плоскостей, от которых происходит дифракция. [c.91] прибегнув к некоторой абстракции, представить себе все дифракционные пятна в виде точек, суш,ествуюш,их в пространстве, окружающем кристал.л. Практически, когда мы получаем рентгенограмму, мы вращаем кристалл, а не рентгеновский пучок и фотопленку. Но это дела не меняет. Существенно, что положение каждого пятна математически точно фиксировано относительно координатной системы кристалла. [c.91] Пре тав1ш себе теперь брэгговское отражение рентгеновского в чка от этой серии плоскостей — это будет прямая лиштя, которая пересечет фотопленку в некоторой точке. Положение этой точки определится вектором = /гА-]-АВ- - С. Легко доказать, что он перпендикулярен плоскостям (/г, к, I) кристаллической решетки, а по величине R, , он обратно пропорционален расстоянию между плоскостями, отражающими рентгеновские лучи. Мы условимся считать эти точки реально существующими в обратном, или дифракционном , пространстве. [c.92] Таким образом, преобразование от пространства кристаллической решетки к пространству обратной решетки есть простострогая математическая формулировка брэгговского закона дифракции. При этом один масштабный параметр — расстояние от кристалла до фотопленки — выбирается произвольно. Само название обратная решетка вполне понятно. Расстояние каждой точки от центра рентгенограммы, по закону Брэгга, обратно пропорционально расстоянию между соответствующими плоскостями в кристалле. Значит, чем ближе плоскости друг к другу, тем более далекие дифракционные пятна получатся на рентгенограмме. Поэтому пространство, в котором образовалась дифракционная картина, носит название обратного пространства. [c.92] Следующая по сложности задача, разрешенная то11 же ис-следовательшщей, было определение структуры витамина В а-В этом случае необходимо было найти из рентгенограммы пространственные координаты 93 атомов, и это удалось осуществить. В итоге была сконструирована пространственная модель молекулы витамина, а следовательно, найдена его структурная формула, т. е. схема расположения ковалентных связей между атомами. [c.93] После этого пришла эра белков, и задача анализа структуры усложнилась неимоверно. В качестве первых объектов были избраны хромопротеиды гемоглобин и миоглобин. [c.93] Гемоглобин — белок крови, содержащий геминовую группу — пигмент с попом железа. Функция гемоглобина — обратимое связывание молекулярного кислорода в красных клетках крови, эритроцитах, и доставка кислорода во все области организма. Молекулярный вес гемоглобина (лошади) 68 ООО. Он состоит из 4 полипептидных цепочек, 2 пз. которых относятся к области А и 2 — к области В. Обе части гемоглобина (А и В) могут быть обратимо отделены друг от друга при кислых pH или путем хроматографии на катионите. Молекула гемоглобина содержит 4 группы гема, фиксированных определенным образом на поверхности глобулы белка глобина (рис. 36). [c.93] Для решения задачи отыскания координат атомов, когда строение молекулы неизвестно, метод проб и ошибок абсолютно непригоден. Необходимо было развить обпщй математический метод, не требующий никаких априорных гипотез и использующий лишь численные данные, получаемые из эксперимента. Принципы такого метода были предложены Брэггом и Перуцом. [c.94] Рассмотрим кристалл, в котором материя имеет периодическое распределение вдоль трех осей с периодами а, Ъ, с (рис. 37). [c.94] Если измерить амплитудные коэффициенты излучения F в отдельных дифракционных пятнах, то это, казалось бы, позволит нам вычислить величины амплитудных коэффициентов ряда Фурье для электронной плотности. [c.95] Макромолекулы белков образуют молекулярную решетку, в которой опи уложены рядом друг с другом. На модели (рис. 38) видна упаковка молекул миоглобина в решетке. Кристаллическая решетка моноклинная, и в элементарную ячейку входят 2 макромолекулы. Сама по себе внутримолекулярная структура миоглобина чрезвычайно сложна, но способ упаковки целых макромолекул в решетке прост. Между макромолекулами столь замысловатой формы с необходимостью должны оставаться зазоры, заполняюш иеся при кристаллизации белка водным раствором. Неудивительно, что кристаллизационная вода заполняет в белковых кристаллах часто половину и даже несколько большую часть всего объема. Высушивание белкового кристалла вызывает обычно нарушение регулярности структуры. Напомним, что белковые кристаллы долгое время вообще не считали за кристаллы, так как они не давали рентгеновской дифракции. Бернал и Дороти Ходжкин показали, что ошибка была в высушивании кристаллов если снимать рентгенограмму с белкового кристалла, находящегося в маточном растворе, удается получить поразительные по детальности рентгенограммы, насчитывающие часто более 20000 независимых рефлексов. [c.96] Черные пластинки — группы гема. [c.97] Таким образом, в каждой ячейке кристалла в определенных точках будут находиться четыре атома ртути, сильно рассеиваю-щ,ие рентгеновские лучи. Сняв картину дифракционных пятен от кристалла ртутного соединения и сопоставляя ее с соответствующими данными для незамещенного белка, мы получим картину рентгеновской дифракции от прострапственпой решетки, состоящей как бы из одних атомов ртути, расставленных в пространстве в точках, где эти атомы прикрепляются благодаря химическому взаимодействию с белком. Решетка атомов ртути, естественно, имеет простую структуру (всего 4 атома ртути в элементарной ячейке). [c.98] Определение дифракционной картины для разностной ртутной решетки представляется непростым делом. Нельзя обойтись простым вычитанием интенсивностей пятен комбинированной рентгенограммы белок—ртуть и рентгенограммы чистого белка. Складываются не интенсивности F а сами амплитудные коэффициенты. Последние определяются модулем и фазой. Это, как говорилось выше, комплексные числа они складываются как векторы на плоскости F j., = Г д к F — амплитудный коэффициент, создаваемый решеткой ртутного деривата,, — амплитудный коэффициент, создаваемый решеткой белка, f — амплитудный коэффициент, создаваемый решеткой атомов ртути. Так как фазы Г и нам неизвестны, то для решения задачи нахождения, не достает данных. Здесь выход из затруднения дает совместное решение векторных уравнений, полученных для нескольких различных соединений тяжелого атома с белком, в частности большую помощь оказывают двойные дериваты, содержащие два разных тяжелых атома в двух точках макромолекулы. Большое облегчение в структурном анализе оказывает наличие оси симметрии кристалла 2-го порядка. Если рассматривать плоскости решетки h, к, I как нормальные к оси симметрии, то в них распределение материи будет иметь центр симметрии. Вращение вокруг оси симметрии на угол 7г, 2г., Зтг и т. д. приводит к повторению всех структурных коэффициентов Отсюда следует, что соответствующие амплитудные коэффициенты дифракционной картины, могут иметь фазы только О и ir. Для этих коэффициентов, разница фаз сводится к разнице знаков амплитудных коэффициентов, так как os 0=1, osn = —1. [c.98] Не останавливаясь на деталях, напомним, что ртутная решетка, хотя элементарная ячейка остается моноклинной, все же примитивна, так как содержит в каждой ячейке немного атомов. Поэтому ее полный рентгеноструктурный анализ осуществляется все же просто н без принципиальных затруднений. А тогда оказывается возможньш вычислить ретроспективно значения всех амплитудных коэффициентов Д для любых плоскостей /г, к, I, причем вычислить их полностью, т. е. определить амплитуды и фазы. Знание всей пространственной картины как в прямом, так и в обратном пространстве для ртутной решетки мы используем для решения основной задачи — нахождения фаз амплитудных коэффициентов белка Опять же для цептросимметричных сечений проблема решается просто, пбо различия в фазах сводятся к различиям в знаках 1, к, 1 к г Ь к 1- Поэтому анализ распределения электронной плотности вдоль оси симметрии кристалла (т. е. суммарной электронной плотности в сечениях, нормальных к оси) был проделан раньше всего и с наименьшей затратой труда. [c.99] Для каждого пятна суммарной решетки мы знаем величину вектора Р, но не знаем фазу или направление. Величина амплитудного коэффициента Р есть попросту корень из интенсивности диффракционного пятна Подобным -же образом мы знаем величину вектора Р к, Для чпсто белкового кристалла при всех значениях индексов /г, к, I. Что касается вектора, , то для него мы знаем всё — и величину, и направление. Поэтому, решая один из треугольников рис. 39, мы получим фазы для амплитудных коэффициентов Р , пР т. е. задача будет решена. [c.99] Вернуться к основной статье