ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Очистка, разделение и идентификация белков из "Введение в молекулярную биологию" В настоящее время в очистке белков, как и во всех других областях белковой химии, произошли огромные изменения. Разработаны методы большой эффективности и универсальности, и задача разделения белков утратила в значительной мере свою исключительность. Выделение новых ферментов превращается в банальную операцию. Все это результат разработки методов хроматографии и препаративного электрофореза. Хроматография — несомненно самый избирательный п общий метод разделения близких веществ — долгое время не могла применяться в должной степени к белкам вследствие трудностей, связанных с денатурацией. При хроматографии акты сорбции и десорбции повторяются сотни раз. Поэтому необходима полная идеальная обратимость процесса сорбции—десорбции. Однако белки благодаря своеобразию структуры частично денатурировались прп сорбции на ионообменных смолах и потому становились нерастворимыми и не могли хроматографироваться. [c.130] В сравнении с хроматографическими методами все другие способы очистки белков за последние годы начинают несколько отступать на задний план. Все же следует упомянуть здесь о препаративном электрофорезе, который применяется довольно широко в разных исполнениях. Для фракционирования малых весовых количеств белков разделение смеси белков на зоны ведут в том или ином стабилизирующем наполнителе для ликвидации конвекционного перемешивания. Пригодными наполнителями являются волокна целлюлозы, в частности бумага. Бумажный электрофорез белков похож на разделение аминокислот и пептидов на бумаге, о чем мы уже говорили выше. Другой широко употребительной средой является гель крахмала, который разрезается на кусочки после завершения электрофореза, и из каждого куска элюируется содержащийся в нем белок. [c.131] В последнее время стали проводить зонпый электрофорез и в отсутствие наполнителей. Для этого в вертикальной трубке создается градиент плотности с помощью градиента концентрации сахара. В градиенте п.чотности конвекционные помехи отсутствуют и электрофоретические зоны устойчивы. В то же время выравнивание градиента концентрации сахара происходит так медленно, что для осуществления электрофореза времени вполне хватает. [c.131] Для разделения больших количеств белков с помощью электрофореза Р13обретено за последние годы немало приборов, однако значение их сейчас весьма проблематично ввиду того, что электрофорез все больше уступает место хроматографии. [c.132] Следует остановится на исторически самых старых методах разделения и очистки белков, основанных на фракционном осаждении и соосаждении, т. е. на разнице в растворимости различных белков. В некоторых случаях, когда разница в растворимости белков может быть очень велика, методы осаждения весьма эффективны и сохраняют свое значение и сейчас. Такой случай представляется, например, когда мы выделяем термостабильный белок, не денатурируемый при нагревании из смеси других белков. Мы прибегаем к нагреву смеси и переводим все белки в малорастворимое денатурированное состояние. Подгоняя pH среды к изоэлектрической точке большинства белков, мы осаждаем все термолабильные белки, и в растворе остается лишь термостабильный белок. Так поступают при выделении рибонуклеазы, миокиназы и ряда других белков. Этот прием позволяет избавиться одним ударом от массы балласта и обогатить раствор нужным компонентом во много раз. [c.132] Другой случай, когда методы осаждения достаточно селективны, это пример белков, образующих малорастворимые соединения с другими полимерами. Здесь используют соосаждение с соответствующими полимерами в качестве приема для выделения фермента из смеси. Так, например, некоторые кислые белки образуют нерастворимые соединения с основными полипептидами про-тамипами, выделяемыми из спермы рыб. [c.132] Все методы фракционного осаждения технически трудны, ибо требуют фильтрования мелких коллоидных осадков, забивающих поры фильтров. Надо полагать, что эти методы доживают свой век и будут полностью заменены более совершенными и эффективными. [c.133] Один из новых приемов, который только начинает развиваться, — многократная многоступенчатая экстракция, так называемое противоточное распределение белков. Оно основано на различии распределения растворенного вещества (в данном случае — различных белков) между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Этот метод применен был Крэгом и другими с большим успехом для очистки множества пизкомолекулярных веществ — коферментов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов и др. Применительно к белкам вначале казалось, что невозможно будет подобрать пары жидкостей, несмешивающихся друг с другом и вместе с тем хорошо растворяющих белки. Чтобы метод экстракции был эффективен, необходимо коэффициент распределения растворенного вещества между /кидкими фазами иметь порядка единицы. [c.133] Оказалось, что для белков можно легко подобрать подобные среды, если использовать трехкомпонептные системы, состоящие из воды, органической жидкости, например глицерина, гликоля, пропнлового или бутилового спирта, и минеральной соли. В таких трехкомпонентных системах происходит разделение па 2 несме-шивающиеся фазы, из которых одна богаче органическим компонентом, вторая минеральной солью. Можно подобрать условия, когда состав обеих несмешивающихся фаз близок, и потому коэффициент распределения белков будет порядка единицы. Для некоторых белков метод противоточного распределения уже успешно применялся. Вполне вероятно, что он окажется практичным в нем отсутствует неприятная специфика работы с коллоидными осадками. [c.133] Кристаллизация белков — процесс сложный и капризный. Однако, когда белок обогащен и сконцентрирован в растворе и освобожден от большей части примесей, очень часто получение его в кристаллическом виде является лучшим способом его окончательной очистки. В настоящее время сотни белков уже получены в кристаллическом состоянии. Обычный путь кристаллизации белка заключается в получении пересыщенного раствора (путем повышения концентрации белка, выбора pH вблизи изоточки, и, наконец, добавления высаливающих агентов, уменьшающих растворимость) в таких плавных и нежных условиях, чтобы не выпал преждевременно аморфный осадок. Общих рецептов для этого не существует и каждый повьш объект требует большой эмпирической работы по подбору условий кристаллизации. После хорошей предварительной очистки белка чаще всего это удается. Однако кристаллики белков микроскопически малы. Для целей рэнтгеноструктурного анализа приходится специально выращивать криста.ллы белков с линейными размерами порядка 1 мм, и это оказывается нелегким делом. [c.134] Контроль за чистотой белков и идентификация полученных продуктов производится тремя способами. [c.134] Во-первых, каждый метод очистки одновременно может служить и методом контроля чистоты. Например, если мы получили индивидуальный белок с помощью хроматографии и, рехроматографи-ровав его вторично, убеждаемся в том, что пмеем дело с однокомпонентным веществом, то это является контролем чистоты препарата. [c.134] Третьим принципом контроля чистоты белков служит определение их функциональной активности — ферментативной, гормональной или любой друго1 1. Функциональная активность на единицу веса препарата, или, что практически то же самое, на единицу белкового азота, — так называемая удельная активность — служит самым лучшим мерилом чистоты любого белка. Для важнейших белков изучены максимальные значения удельной активности, и эти цифры служат стандартами, с которыми обычно сравнивают получаемые в лабораториях препараты. Ясно, что измерения любого вида функциональной активности должны производиться в стандартизованных условиях при со-блюденпи всех необходимых предосторожностей. [c.135] Вернуться к основной статье