ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Принципы действия активных центров О-гликозид-гидролаз из "Ферментативный катализ" О-Гликозид-гидролазы (КФ 3.2.1), или карбогидразы,— ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление О-гликозидной связи. Эти ферменты заггимают весьма заметное место как в классической и физико-химической эггзимологни, так и в прикладной, энзимологии и биотехнологии. [c.22] Вопрос о субстратной специфичности карбогидраз довольно сложен. А. Я. Хорлин в своем блестящем обзоре [11] отмечал Абсолютной специфичностью карбогидразы во всех случаях обладают лишь по отношению к двум элементам структуры субстрата— к конфигурации расщепляемой гликозидной связи и к размеру окисного цикла отщепляемого моносахаридного остатка. В остальном для них характерна определенная широта специфичности, границы которой изучены слабо . Однако за 10 лет, прошедшие со времени данного высказывания, появились довольно многочисленные исключения и для этих двух элементов субстратной структуры. [c.23] Важнейший вопрос энзимологии — как выявить взаимосвязь между механизмом действия и специфичностью фермента, с одной стороны, строением и свойствами его активного центра, с другой,— для карбогидраз в значительной степени остается открытым. В литературе появилось довольно много экспериментальных. данных по механизмам действия и специфичности 0-гликозид-гид-ролаз, однако следует отметить, что в подавляющем большинстве случаев их интерпретация проводится лишь по аналогии с действием лизоцима, даже без достаточных на то оснований. [c.23] если начальные скорости ферментативного гидролиза субстрата и накопления одного из продуктов гидролиза Р совпадают, в то время как начальная скорость накопления второго (апомерно-го) продукта Р равна (или близка) нулю, то первичным продуктом является Р ( рис. 1). Измерение концентрации продуктов Р и Р во времени может быть проведено различными методами поляриметрически, с помощью ЯМР, тонкослойной, газожидкостной или высокоэффективной жидкостной хроматографии и т. п. [c.25] Принципы построения и специфичность действия активных центров эндо- и экзогликаназ подробно рассмотрены далее в главе второй настоящей книги. [c.29] Известно, что кинетику ферментативных реакций можно изучать с помощью регистрации либо начальных участков кинетической кривой, либо достаточно протяженных ее участков (практически до полного завершения реакции) [21]. В первом случае изучение преврапгений полимеров не отличается принципиально от изучения реакций любых других (простых) субстратов, поскольку в начальный период реакции ферментативной атаке могут подвергаться различные по реакционной способности участки полимера в зависимости от их относительного содержания и относительного сродства фермента к ним. Поэтому соответствующие эффективные кинетические параметры ферментативной реакции (константы Михаэлиса, каталитические константы) являются некоторыми средними величинами и не могут быть использованы для описания и теоретического предсказания временного хода ферментативного процесса на достаточно больших глубинах превращения полимеррюго субстрата. [c.29] Полученные значения констант Михаэлиса и максимальных скоростей реакций для исходного и промежуточных олигомеров ввели в математическую модель действия глюкоамилазы и с помощью ЭВМ получили кинетические кривые накопления глюкозы прн гидролизе мальтодекстринов (рис. 2). Теоретические кривые близки по характеру к экспериментальным. Отличие заключается в том, что в них не отражается ингибирование продуктами реакции (поскольку ингибирование не вводилось в математическую модель). Тем не менее обработка теоретических кривых в рамках интегральной формы уравнения скорости (рис. 3), которая обычно проводится при анализе кинетических кривых простых ферментативных реакций [21], свидетельствует о наличии сильного ингибирования продуктами реакции в данной системе. На это указывают положительные угловые коэффициенты соответствующих прямых в известных координатах [Р]/ 1//1п ([5]о/[8]а — [Р]) для различных начальных концентраций исходного субстрата (рис. 3) . [c.32] Таким образом, прогрессивное уменьшение реакционной способности фермента в ходе деградации полимерного субстрата практически эквивалентно прогрессивному уменьшению скорости ферментативной реакции из-за ингибирования образующимися продуктами. Как показано в настоящем разделе, эти два случая практически не различимы в интегральных методах кинетического анализа протяженных участков кинетических кривых. Единственным критерием ингибирования продуктами реакции при гидролизе полимерных субстратов является прямой тест на ингибирование самими продуктами реакции, выделенными непосредственно из реакционной системы илн полученными независимыми методами. [c.34] Каждая молекула полимерного субстрата фактически представляет собой целый спектр субстратов (реакционных центров) с различной реакционной способностью. При этом реакционная способность полимеров, как правило, убывает в ходе его ферментативной деструкции. Это приводит к своеобразным эффектам в кинетике ферментативной деградации полимерных субстратов, которые трудно (а часто невозможно) отличить от эффекта ингибирования реакции продуктами ферментативного гидролиза. Поэтому, прежде чем на основании кинетического изучения реакции делать окончательный вывод о наличии значительного ингибирования продуктами и, более того, давать рекомендации по поводу соответствующей конструкции ферментного реактора для практических целен, необходимо проверить ингибирующую способность продуктов с помощью прямых методов, добавляя продукты гидролиза непосредственно в реакционную систему. [c.35] Вернуться к основной статье