ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы исследования экологии микроорганизмов из "Микробиология" Выделение микроорганизмов из экологических ниш и проблемы, связанные с некультивируемыми формами. По некоторым оценкам, исследователи могут культивировать меньше 0,1 % всего микробного разнообразия. Десятки тысяч видов микроорганизмов, живущих как симбионты животных и растений, нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относят к так называемым некультивируемым и таким образом остающимся недоступными классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение. Такие методы объединяют прямые микроскопические наблюдения и различные приемы на основе молекулярной диагностики, включая амплификацию диагностирующих последовательностей генома, кодирующих синтез молекулы 168 рРИК для последующей их расшифровки. [c.245] Методы прямого прижизненного окрашивания различных проб воды, почвы и осадков позволяют выделять гораздо больше живых клеток, чем высевы на различные среды. Большое расхождение в результатах прямого счета в сравнении с высевом на среды поставило вопрос прижизненно окрашенные микроорганизмы являются живыми или мертвыми Применение в качестве прижизненного красителя акридинового оранжевого показало, что часть клеток окрашивается с последующей зеленой флуоресценцией, часть — остается оранжевой. Это привело вначале к неверному выводу о том, что зеленые клетки — живые, а оранжевые — мертвые. Впоследствии было выяснено, что цвет флуоресценции зависит от отношения ДНК/белок в клетке, в результате активно делящиеся клетки выглядят зелеными, а растущие более медленно или покоящиеся клетки дают оранжевую флуоресценцию, оставаясь при этом живыми. [c.245] В дальнейшем были разработаны прямые методы оценки ме-таболитической активности клеток (клеточное дыхание), позволяющие отличить живые клетки от неживых в природных пробах. [c.245] Методы основаны на применении различных солей тетразо-лия, которые при восстановлении в клетке дегидрогеназами (дыхательная активность) превращаются в нерастворимый формазан красного цвета, что можно обнаружить визуально под микроскопом. Имеется способ различать живые, мертвые и поврежденные клетки при измерении состояния мембранного потенциала с помощью флуорохромов. Другой способ предлагает добавлять к пробам живых клеток ингибитор клеточного деления (налидиксовую кислоту), при этом активно растущие клетки будут удлиняться без вступления в фазу бинарного деления. [c.246] Для наблюдения за некультивируемыми формами микроорганизмов в природных образцах применяют методы молекулярного анализа. Разработано несколько десятков диагностических проб-последовательностей ДНК/РНК для специфического обнаружения определенных видов, родов, семейств или таксонов более высокого порядка непосредственно в природных образцах. [c.246] С использованием таких последовательностей было обнаружено, что морские воды содержат многие виды архей и бактерий, которые не поддаются культивированию в лаборатории. [c.246] Олигонуклеотидные пробы длиной 18 — 20 нуклеотидов являются наиболее подходящими для такой диагностики, так как легко гибридизуются со специфическим участком ДНК искомого организма. [c.246] Даже небольшие количества некультивируемых форм могут быть обнаружены в популяциях природных образцов с помощью ПЦР-амплификации диагностических последовательностей ДНК. [c.246] Жизнеспособные клетки микроорганизмов можно идентифицировать также с помощью специфических иРНК методом обратной транскрипции, но при использовании этого метода следует помнить о том, что время полужизни некоторых бактериальных иРНК может составлять меньше минуты. [c.246] Вернуться к основной статье