ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Характер ферментов и механизм гидроксилирования из "Микробиологические трансформации стероидов" Большинство работ по микробиологическому гидроксилированию стероидов охватывает преимущественно химическую сторону проблемы, в то время как механизм этой реакции и природа участвующих в ней ферментов остаются недостаточно изученными. Это положение в значительной мере объясняется тем, что до сих пор из микроорганизмов не удалось выделить чистых препаратов ферментов, ответственных за гид-роксилирсвание, и даже активные бесклеточные экстракты были получены лишь в самое последнее время [139, 140]. Стероид-гидроксилазы оказались крайне неустойчивыми так, частично очищенные препараты ИР- и 14а-стероид-гидроксилаз теряли активность за 24 часа даже при выдерживании на холоде (от —30 до 0°) [139]. Поэтому выводы о природе ферментов приходилось делать на основании изучения цельных культур, что приводило к различным противоречиям. [c.85] С другой стороны, при гидроксилировании прогестерона urvularia lunata было показано, что культуры, выращенные как в присутствии, так и в отсутствие прогестерона, начинают превращать субстрат немедленно после внесения, т. е. в метаболизме отсутствует лаг-фаза (индукционный период) [142, 144]. Отсюда был сделан вывод, что стероид-гидроксилазы в данном случае являются конститутивными ферментами. По-видимому, характер образования гидроксилирующих ферментов может быть различным у разных видов микроорганизмов. Весьма вероятным представляется также предположение, что большинство микроорганизмов содержат малые количества стероид-гидроксилаз, активность которых резко возрастает при контакте с субстратом, как это имеет место для оксистероид-дегидрогеназ (см. гл. П1, стр. 121). [c.86] Необходимость кислорода следует из того факта, что в анаэробных условиях бесклеточные экстракты urvularia lunata не производят гидроксилирования [139]. Вводимый в молекулу стероидов с оксигруппой кислород целиком берется из воздуха, что было показано опытами с 02 и Нг 0 для бр-, 11а-, Ир-, 12р-, 15а-, 17а- и 21-гидроксилирования микроорганизмами [148—150]. Непосредственное участие молекулярного кислорода и отсутствие вхождения изотопов из H. 0 и D O было также доказано для согласованного гидроксилирования и циклизации сква-лена в ланостерин [147]. [c.87] Происхождение кислорода гидроксильной группы из воздуха и отсутствие непосредственного участия воды при гидроксилировании позволяют отвергнуть возможность промежуточного образования дегидропроизводных при этом процессе. Такое предположение было выдвинуто по аналогии с ферментативным превращением янтарной кислоты через фумаровую в яблочную кислоту считалось, что гидроксилирование, например, в положение И стероидной молекулы, могло протекать через или А 11-соединения по схеме [151, 152]. [c.87] Большое число работ было посвящено изучению влияния различных добавок к питательной среде на ход микробиологического гидроксилирования стероидов. Интересные данные было получены при добавлении кислот и витаминов. При микробиологическом гидроксилировании прогестерона urvularia lunata было показано, что янтарная и особенно яблочная кислоты, которые способны непосредственно дегидрироваться, благоприятствуют гидроксилированию, тогда как фумаровая кислота, являющаяся акцептором водорода, действует подавляюще [142]. Эти результаты указывают на большую роль процессов переноса водорода при гидроксилировании. К тому же выводу привело изучение влияния витаминов на протекание гидроксилирования. В то время как витамины Bj и В(, имеют слабое ускоряющее воздействие на процесс гидроксилирования и никотинамид вообще на него не влияет, витамин Bj (рибо--флавин) более чем вдвое увеличивает выход продуктов гидроксилирования [142]. Поскольку витамин Bj является составной частью переносящего водород флавинового фермента, подобные процессы должны играть существенную роль при гидроксилировании стероидов. [c.87] Изложенные данные приводят к выводу о том, что при гидроксилировании стероидов большую роль играет фермент, содержащий тяжелый металл. Среди таких ферментов в первую очередь следует учитывать Ре-содержащие ферменты типа пероксидазы и Сп-содержащие ферменты типа фенолоксидазы. Чтобы установить, к какой из этих групп принадлежат стероид-гидроксилазы, было изучено влияние следов Fe и Си на гидроксилирование стероидов urvularia lunata [142, 153] (рис. G). Рис. 6 показывает, что добавление ионов железа резко увеличивает выход продуктов гидроксилирования, в то время как добавление ионов меди такого действия не проявляет. Следует поэтому сделать вывод о том, что при гидроксилировании стероидов в данном случав принимает участие железосодержащий фермент. [c.88] Таким образом, ферментативное гидроксилирование происходит путем непосредственного замещения водорода без вальденовского обращения, т. е. входящая оксигруппа занимает то же положение, что и замещенный ею водород. То же относится и к третичному гидроксилированию в положения 5р, 8р, 9а, юр, 14а и 17а. [c.90] При этом молекула кислорода получает четыре электрона, а молекула субстрата теряет два электрона. Если 1 моль кислорода пе окисляет 2 моля субстрата, то становится необходимым добавочный восстановитель. Эта общая схема сразу указывает на возможную функцию НАДФ, который при окислении образует молекулу воды, но эта схема ничего не дает для выяснения вопроса о способе активации кислорода. [c.91] Поскольку одна и та же ферментная система может осуществлять и гидроксилирование, и эпоксидирование стероидов (см. раздел 4), ферментный реагент может быть сравнен с перекисью или надкислотой. Естественно было предположить, что в гидроксилировании непосредственно участвует перекись водорода, которая может генерироваться при окислении НАДФ. Однако все попытки катализировать гидроксилирование стероидов непосредственным добавлением НгО или Н Оа-генерирующей системы неизменно заканчивались неудачей и, более того, реакция гидроксилирования оказалась нечувствительной к катал 1зе [142, 145, 147, 158, 159]. Эти данные позволяют отвергнуть непосредственное участие перекиси при гидроксилировании. [c.92] В таком случае следует считать, что окисляющий кислород непосредственно связан с ферментом и гидроксилирование представляет собой непосредственную электрофильную атаку ферментного реагента на соответствующую С—Н-связь. При этом вполне возможно предположить, что гидроксилирующие частицы представляют собой хелаты катиона, содержащего кислород, заимствованный из атмосферы [147 ]. Этот хелат может содержать четырехвалентное железо в виде феррил-катиона, образование которого из молекулярного кислорода требует источника электронов (НАДФ). Схема гидроксилирования субстрата (8—Н) в этом случае может быть записана следующим образом . [c.92] В то время как ферменты для реакций 1 и 3 имеют общую природу, реакция 2 специфически определяет положение и конфигурацию входящей в стероид гидроксильной группы. [c.92] Вернуться к основной статье