ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Характер ферментов и механизм реакции из "Микробиологические трансформации стероидов" Оксистероид-дегидрогеназы (ОСД), катализирующие обратимые реакции окисления-восстановления кислородных заместителей, являются наиболее изученными из трансформирующих стероиды ферментов. Три их представителя — За-, Зр,17р- и 20 5-ОСД — удалось выделить в кристаллическом состоянии. Это позволило детально изучить кинетику реакций и влияние на нее структурных особенностей стероидных субстратов, а также стереохимию ферментативных процессов. Некоторые представители оксистероид-дегидрогеназ нашли применение в микроаналитическом определении окси- и кетостероидов. [c.118] Выделение оксистероид-дегидрогеназ осущест-вляется обычными в химии ферментов методами. После разрушения клеток ультразвуком или растиранием с AlgOg полученные бесклеточные экстракты центрифугируются и ферменты, содержащиеся в надосадочной жидкости, выделяются комбинированием различных методов — хроматографии на ионообменниках, гелевой фильтрации, фракционированного осаждения сульфатом аммония и т. д. Удельная активность экстрактов увеличивается при этом в десятки и сотни раз. [c.119] Первыми из выделенных оксистероид-дегидрогеназ были ферменты из адаптированных к тестостерону клеток Pseudomonas testosteroni За- и Зр,17 3-оксистероид-дегидрогеназы [127, 128] недавно появилось сообщение [129] об улучшении метода разделения этих ферментов с применением гелевой фильтрации. Очищенные препараты ферментов в кристаллическом состоянии могут храниться при —20° С не менее года без потери активности, но в разбавленных растворах при 0° они медленно инактивируются [130, 131]. Определенный седиментационным методом молекулярный вес За-оксистероид-дегидрогеназы равен 47100 + 1500, а Зр, 17Р-оксистероид-дегидрогеназы — 100000 + 600 молекулярная активность первого фермента равна 9300 мин. (андростерон, 25° С), а второго — 18600 мин. (тестостерон, 25° С) [132, 133]. Определен также аминокислотный состав обоих ферментов [132]. [c.119] Полученный путем многократных пересевов мутант Р. testosteroni также вырабатывает За-ОСД, но вместо Зр, 17р-0СД продуцирует Зр-оксистероид-дегидрогеназу, которая способна окислять андростенолон, но не тестостерон [134]. Таким образом, фермент из мутантных клеток более специфичен, чем описанный ранее. [c.119] Основные характеристики оксистероид-дегидрогеназ, выделенных до настоящего времени, приведены в табл. 32. [c.120] Все оксистероид-дегидрогеназы, как и другие ферменты, связанные с пиридиннуклеотидами, требуют для своей активности восстановленных сульфгидрильных групп и поэтому легко инактивируются ионами тяжелых металлов — Си , Fe и Hg++ [131, 150]. [c.120] Ингибирующей активностью по отношению к Зр,17]3-ОСД обладают также эстрогенные гормоны и синтетические фенольные аналоги эстрогенов. Ингибирующая активность этих соединений резко возрастает с увеличением pH среды по-виднмому, в случае фенольных соединений одним из факторов, благоприятствующих более тесному связыванию с ферментом, является образование фонолят-пона [128, 152, 153]. [c.121] Образование индуцированного фермента начинается через 2—6 час. после внесения индуктора при этом лучшие результаты достигаются при добавлении индуктора в фазе активного роста микроорганизма, а не после ее окончания [130, 154 ]. Связь строения индуктора с 41ндуцирующей активностью была изучена на примере За-, Зр,17р- и 20р-оксистероид-де-гидрогеназ. Было показано, что образование первых двух ферментов индуцируется независимо от того, содержит ли индуктор За-, или Зр, 17р-оксигруппы (табл. 33) [130]. [c.121] Контроль (без добавления стероида). [c.122] Прегнадиен-4,17 (20)-дпол-11 р, 21-ои- 5. . [c.122] При сравнении зависимости индуцирующего действия стероидов от их концентрации бросается в глаза характерная разница в форме кривых (рис. 7) [155]. Эстрон (кривая А) совершенно неактивен, вероятно, из-за ароматического характера кольца А. Кортексон Б), прогестерон В) и прегнадиен-4,17(20)-диол-11р,21-он-3 (Г) имеют максимум индуцирующей активности при очень низких концентрациях (20у/лл для первых двух стероидов и 100у/лл для третьего) при дальнейшем увеличении концентрации активность их резко уменьшается. Совершенно иначе ведут себя кортизол Д) и тестостерон Е), у которых с возрастанием концентрации медленно увеличивается индуцирующая активность, не достигающая максимума даже при 200 у мл. Сопоставление структуры двух типов индукторов показывает, что стероиды первой группы (Б, В, Г) не имеют кислородного заместителя при С , а у стероидов второй группы Д, Е) он имеется. Из исследований специфичности восстановления 20р-0( 1Д по отношению к субстрату известно, что связанный с С , кислород существенно повышает скорость восстановления. По-видимому, этот заместитель имеет значение и для механизма действия при индукции. В то же время другие факторы, как, например, структура боковой цепи, влияют лишь на силу действия. [c.122] Таким образом, индукцию оксистероид-дегидрогеназ следует рассматривать как сложный процесс, в равной мере зависящий от химического строения и концентрации индуктора. [c.122] Поскольку Н входит в уравнение реакции (1), положение равновесия и скорость его достижения зависят от pH скорость окисления возрастает с увеличением pH, а скорость восстановления — с уменьшением pH. [c.122] Вернуться к основной статье