ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Предисловие к русскому изданию из "Методы исследования нуклеиновых кислот" Перечень содержания этого прекрасного методического руководства свидетельствует о действительно широком охвате представленных методов изучения нуклеиновых кислот как со стороны их химической природы, так и со стороны их биологической роли. Все методы описаны достаточно детально и критически. Во всяком случае, пользуясь этим руководством, можно с успехом работать. Большое достоинство руководства в том, что отдельные главы написаны исследователями, которые сами непосредст-пенно используют описываемые ими методы и многие из которых сделали существеииые вклады в разработку методов изучения тех или иных сторон структуры и биологической роли нуклеиновых кислот. [c.5] Мы надеемся, что эта методическая книга будет весьма нужной и полезной всем тем, кто занимается нуклеиновыми кислотами или иптересу- тся этой группой соединений. [c.5] Оригинальная методика Дише уже была описана в одном из томов этой серии [9]. В этой статье будут приведены последние модификации метода. Для ДНК было описано еще несколько цветных реакций [2], но по чувствительности и простоте выполнения ни одну из них нельзя сравнить последними модификациями дифениламиновой реакции. [c.7] Реактивы. Водный раствор а ц е т а ль де ги да (1,6%-ный). Охлажденной пипеткой добавляют к 1 мл охлажденного ацетальдегида 50 мл воды. Можно использовать продажный ацетальдегид, если он свежий в противном случае его следует смешать с разбавленной серной кислотой и перегнать. Водный раствор ацетальдегида можно хранить в течение нескольких месяцев нри 4° в плотно закрытой склянке. [c.7] Приготовление растворов ДНК. Если неизвестный материал содержит белки, их удаляют, а ДНК экстрагируют 0,5—1,0 п. хлорной или 5%-ной трихлоруксусной (ТХУ) кислотой при нагревании. Если используют ТХУ, то к экстракту необходимо добавить хлорную кислоту (на холоду) до конечной концентрации 0,5—1,0 н. Во многих случаях удовлетворительные результаты дает экстракция 0,5 н. хлорной кислотой в течение 20 мин при 70° или 5%-ной ТХУ в течение 10 мин при 90°. В этих условиях разрушается менее 5% дезоксирибозы [2]. [c.8] Все пробы инкубируют 15—17 час нри 25—30° и затем измеряют их оптическую плотность при 600 ммк. При оптимальной концентрации ацетальдегида интенсивность окраски увеличивается пропорционально концентрации ДНК (примерно 0,37 на 0,1 мкмоль фосфора ДНК в пробе с конечным объемом 3 мл). Если исследуемый образец был обработан кислотой, интенсивность окраски достигает примерно 80% от максимальной за 5 час нри 35°. С повышением температуры окраска развивается быстрее, однако нри этом чувствительность реакции понижается (2, 3]. [c.8] Присутствие в пробе белков не всегда вызывает помутнение, однако они могут ингибировать развитие окраски, в особенности после обработки щелочью [8]. Возможно, это связано с действием щелочи на дисульфидные мо стики, так как 0,35 мг цистина, обработанного NaOH в течение 1 час нри 70°, снижают на 20% интенсивность окраски в пробе, содержащей 1 мл раствора ДНК ж2 мл дифениламинового реактива. [c.9] Крофт и Любран [3] измеряли концентрацию ДНК в тканях желудка человека, промытых солевым раствором. Этот материал содержит большое количество сиаловой кислоты, которая сильно ингибирует ряд цветных реакций на ДНК, в том числе и реакцию с дифениламином в модификации Бартона. При этом сама сиаловая кислота реагирует, образуя окрашенный продукт (максимум поглощения при 550 ммк). Если сиаловая кислота находится в смеси с ДНК, то она, кроме того, подавляет развитие окраски, обусловленной присутствием ДНК (поглощепие 600 ммк). Можно провопить измерения нри двух длинах волн и том самым учесть вклад сиаловой кислоты в цветную реакцию, однако более надежные результаты получают, проводя цветную реакцию при низкой температуре (например, нри 6—13° в течение 48 час). В этом случае определение выполняют так же,, как и но методу Бартона [2], с той разницей, что реактив содержит 2 % дифениламина вместо 1,5%. [c.9] Эти авторы нашли, что интенсивность окраски контрольной пробы можно понизить, если исключить из реактива серную кислоту, а ацетальдегид добавлять к каждой пробе по отдельности. Кроме того, им удалось значительно повысить чувствительность реакции, увеличив концентрацию дифениламина и изменив соотношение между объемами образца и реактива. [c.9] Методика. Образец и стандартные пробы готовят, нагревая их в Юноной (1 Н.) хлорной кислоте. Пробу соответствующего объема смешивают с равным объемом свежеприготовленного 4%-ного раствора дифениламина в ледяной уксусной кислоте, затем прибавляют водный 1,6%-ный раствор ацетальдегида (0,05 от объема образца или реактива). Полученные растворы смешивают и инкубируют в течение ночи при 30° поглощение измеряют при 595 ммк. [c.9] При определении концентрации ДНК в экстрактах из растительных тканей Джилес и Майерс наблюдали помутнение реакционной смеси. Ошибку, которая появляется за счет этого помутнения, можно исключить, если проводить измерения при 595 и 700 ммк. Пока еще не известно, мешает ли в этом случае присутствие сиаловой кислоты однако этого осложнения, по-видимому, можно избежать, инкубируя пробы при нопиженной температуре. [c.9] Для удаления солей водный раствор ДНК диализуют против воды и смешивают затем с двумя объемами 987о-ной или 2,8 объема 90%-ной муравьиной кислоты. Этот раствор инкубируют 17 час при 30°, затем добавляют к нему 0,5 объема воды и 4 объема эфира, встряхивают и эфирный слой отбрасывают. Экстракцию эфиром повторяют дважды и водный раствор пропускают через колонку с дауэксом 50 (Н+) при 0° (для 0,5 г ДНК используют колонку длиной 12 см и диаметром 5 см). Свободные пурины адсорбируются на ионообменнике апуриновую кислоту выделяют, промывая колонку водой около 2 час, пока апуриновая кислота не перестанет обнаруживаться в элюате (поглощение при 260 ммк полностью отсутствует или очень незначительно). Для удаления муравьиной кислоты элюаты объединяют и высушивают путем лиофилизации до тех пор, пока не образуется густая влажная масса апуриновой кислоты (кислотная форма). Важно отметить, что концентрирование апуриновой кислоты следует прекращать, когда вода удалена не полностью и температура колбы не повысилась до комнатной. Апуриновую кислоту сразу же растворяют в холодной воде и тщательно нейтрализуют натриевой щелочью. Натриевую соль апуриновой кислоты можно выделить из раствора путем лиофилизации. Средневесовой молекулярный вес такой апуриновой кислоты равен 57 ООО [5]. Это значение намного выше того, которое найдено для апуриновой кислоты, полученной нри диализе ДНК против минеральных кислот [6, 7]. [c.11] Вернуться к основной статье