ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Установление структуры углеводных составляющих углевод-белковых комплексов из "Химия биологически активных природных соединений" Выделение углевод-белковых полимеров является сложлым процессом вследствие трудности отделения примеси белков или полисахаридов. Кроме того, при выделении нередко наблюдается деструкция полимера. [c.74] Для выделения таких биополимеров широко применяется фракцио- нированное осаждение ( апример, спиртом), позволяющее отделить некоторые гликопротеины от белков. Для отделения белков используют также осаждение солями или экстракцию фенолом. Применение различных видов хроматографии (иониты, сефадексы) позволяет получить достаточно чистые препараты углевод-белковых комплексов. [c.74] Многие гликопротеины устойчивы к действию протеолитических ферментов, поэтому сопутствующие белки могут быть разрушены ферментами. Удаление примесей гликуроногликозиламиногликанов удается иногда путем деструкции их гиалуронидазой. [c.74] Существует ряд общепринятых методов определения гомогеиности препаратов углевод-белковых полимеров. [c.74] Прежде всего необходимо определить понятие гомогенность для рассматриваемого класса соединений, посколоку оно отличается от аналогичного понятия в применении к белкам. Углевод-белковые полимеры полидисперсны, т. е. препараты индивидуальных биополимеров состоят из молекул в общем одинакового химического строения, отличающихся друг от друга лишь незначительно, например небольшими изменениями молекулярной массы, различным количеством сиаловых кислот [601. Полидисперсность иногда является следствием воздействия протеолитических ферментов или других реагентов, применяющихся при обработке, но вместе с тем она является характерной природной особенностью полимеров данного типа. Когда говорят об индивидуальности гликопротеинов и других углевод-белковых соединений, то имеют в виду, что данная фракция содержит смесь близких по структуре и свойствам соединений, которая теоретически может быть разделена на более узкие фракции. [c.74] Широко используемым методом контроля индивидуальности этих соединений является ультрацентрифугирование. [c.74] Для разделения гликопротеинов используется также метод электрофореза. Электрофорез в растворах, так называемый свободный электрофорез, проводится в ячейке Тизелиуса. Признаком гомогенности служит наличие одиночного пика при двух или трех достаточно дале-тх значениях pH. На подвижность вещества при электрофорезе влияют два независимых фактора заряд вещества и гидродинамическое сопротивление. При взаимной компенсации этих факторов два различных вещества могут иметь одинаковую подвижность, но это не может повторяться при различных pH. [c.74] Другой тип электрофореза осуществляется в поддерживающих средах, например в гелях (крахмал, агар-агар, полиакриламид), что значительно повышает разрешающую силу электрофоретического анализа и позволяет работать с малыми количествами веществ. В качестве примера можно привести разделение препарата фетуина в геле. По данным ультрацентрифугирования и иммуноэлектрофореза этот препарат гомогенен, однако при электрофорезе на поливинилхлориде при pH 8 он разделяется на несколько фракций, отличающихся содержанием сиаловых кислот. Такое же тонкое разделение этого препарата удалось достичь на ДЭАЭ-сефадексе. Следует отметить, что хроматография на колонках и гель-фильтрация дают достаточно полное представление о гомогенности и широко применяются в практике. [c.74] В методе иммунодиффузии наблюдается полоса преципитадии при диффузии препарата в гель, содержащий антитела. Каждая система антиген—антитело образует свою полосу. Диффузия может быть проведена в тонкой пленке геля или в вертикальных трубках. При помощи иммунофореза можно разделить очень сложную смесь близких по физико-химическим свойствам гликопротеинов. Первоначально проводится электрофорез в агар-агаровом геле, а затем иммунодиффузия ( перпендикулярном направлении). [c.75] Методы, основанные на иммуно-химичеоких свойствах веществ, в последнее время широко используются при работе со многими гликопротеинами, например с веществами групп крови, которые проявляют сильные антигенные свойства. Разработаны методы количественного определения их преципитатов с сыворотками. [c.75] Рассмотренные методы используются не только для определения чистоты глико-протеинов, но и для изучения их тонкой структуры. [c.75] Наряду с перечисленными методами применяют приемы и методы анализа, принятые в химии белка, например определение концевых аминогрупп и др. Полное доказательство гомогенности исследуемых веществ может дать только сочетание нескольких различных методов. [c.75] Молекулы углевод-белковых полимеров разнообразны по форме и молекулярной массе. Они могут быть сильно вытянуты или иметь форму глобулы. Гликопротеины, содержащие небольшое количество углеводов и близкие по свойствам к белкам, не представляют трудностей для физико-химических определений. Богатые углеводами гликопротеины и полисахарид-белковые комплексы с высокой молекулярной массой и большим количеством заряженных групп, напротив, являются трудными объектами для изучения. [c.75] Основные отличия гликопротеинов от белков заключаются в поли-диоперсности, высокой степени пространственной асимметрии и высокой плотности заряда. Вследствие этого в растворах конфигурация молекул рассматриваемых биополимеров зависит от типа растворителя, концентрации вещества, pH и ионной силы раствора, что безусловно затрудняет применение классических методов белковой химии к изучению таких веществ. [c.75] Существенную информацию о форме молекул полимеров, содержащих углеводы и белки, дает электродная микроскопия и дисперсия оптического вращения. [c.76] Для получения достаточно достоверных значений молекулярной массы и размеров молекулы следует использовать несколько методов определения. [c.76] Как указывалось выше, имеются различные типы углевод-белковых соединений, отличающихся по составу и строению углеводных фрагментов и их размерами по отношению к пептидным компонентам. Эти различия определяют способы выделения и очистки таких биополимеров, а также выбор методов, дающих возможность определить струк туру соединений или их отдельных участков. Для структурных исследований необходимо использовать препараты веществ, полностью очищенные от примесей. [c.76] Углеводные составляющие углевод-белковых полимеров представлены олиго- или полисахаридами. Для устаиовлеиия их структуры применяют различные методы деградации кислотный и ферментативный гидролиз, периодатное окисление, метилирование и гидролиз, расщепление щелочами. Однако исследуемые биополимеры не всегда могут быть сразу подвергнуты деградации из-за нерастворимости, недоступности атакуемых участков вследствие пространственных затруднений и наличия заряженных групп, затрудняющих атаку расщепляющих реагентов. Существенные трудности для гидролиза представляют остатки аминосахаров и уроновых кислот, гликозидные связи которых устойчивы, поэтому предварительно часто осуществляют превращение этих остатков в производные, не затрудняющие гидролиз. [c.76] Дальнейший анализ этих кизкомолекулярных соединений заключается в определении их молекулярной массы, состава, порядка соединения отдельных моносахаридов, типа и конфигурации гликозидных связей с помощью методов, разработанных для исследования строения сложных углеводов. [c.76] Вернуться к основной статье