ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы установления структуры фосфолипидов из "Химия биологически активных природных соединений" Для изучения структуры фосфолипидов используют комплекс химических, ферментативных и физико-химических исследований. [c.270] Химические методы. Для анализа фосфолипидов часто используют методы частичного или полного гидролиза или алкоголиза [117]. Так, с целью определения жирнокислотного состава фосфолипидов проводят их метанолиз и полученные метиловые эфиры жирных кислот анализируют с помощью газо-жидкостной хроматографии. Щелочной гидролиз спиртовым раствором едкого натра дает водорастворимые фосфо-эфиры, которые могут быть разделены и идентифицированы с помощью бумажной хроматографии. [c.270] В процессе щелочного и кислотного гидролиза фосфолипидов возможны вторичные изменения (например, миграция фосфатного остатка, рацемизация), в связи с чем следует проявлять определенную осторожность при интерпретации полученных данных [118]. [c.270] Для определения положения жирных кислот в фосфолипидах используют метод ацетолиза. Ацетаты, получаемые при действии уксусного ангидрида на фосфолипиды, исследуют методами газо-жидкостной или тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем, им-прегнированным AgNOз, где достигается их разделение по длине цепи, степени ненасыщенности, а также разделение изомеров с различным положением ацильных групп. [c.270] С помощью химических методов проводят определение присутствующих в фосфолипиде функциональных групп например, используют ацилирование (ОН- и МНг-группы), периодатное окисление (вицинальная гликольная группировка), реакцию с 2,4-динитрофторбензолом (МНг-группа) и т. д. Титрование кислотами и основаниями в неводной среде позволяет определить тип фосфолипида и его чистоту. [c.270] Способность к соле- и комплексообразованию часто позволяет различать типы фосфолипидов. Например, фосфатидилхолины легко образуют комплексы с СёСЬ, а кислые фосфолипиды дают свинцовые соли. [c.270] Для качественного и количественного анализа фосфолипидов в настоящее время широко используют тонкослойную хроматографию на силикагеле [3]. При этом применение специфических реагентов, дающих характерное окрашивание для отдельных классов фосфолипидов, помогает осуществить их идентификацию. С помощью ТСХ может быть достигнут количественный анализ фосфолипидов при проведении ден-ситометрических измерений пятен после проявления хроматограммы или путем анализа элюированных веществ на содержание фосфора. [c.270] Ферментативные методы. Для изучения структуры фосфолипидов широкое распространение получили ферментативные методы, с помощью которых осуществляется специфическое расщепление сложноэфирных связей фосфолипидов [119, 120]. [c.271] В большей степени изучено строение фосфолипазы Аг (фосфатид-ацилгидролазы, ЕС 3.1.1.4), обнаруженной в различных тканях животного организма (поджелудочная железа, печень, почки, мозг и т. д.) [121], змеином и пчелином яде, а также в некоторых бактериях (например, Е. СоИ) [122]. [c.271] Фосфолипаза Аг поджелудочной железы свиньи [123] представляет собой белок с молекулярной массой 14 000, присутствует в виде ферментативно неактивного зимогена, активация которого достигается расщеплением связи Arg—Ala, что приводит к образованию фосфолипазы Аг и гептапептида. Фосфолипаза Аз содержит 123 аминокислоты и 6 дисульфидных мостиков. Определена полная аминокислотная последовательность фермента и расположение дисульфидных связей. [c.271] В микросомальных фракциях различных тканей млекопитающих, (мозг, поджелудочная железа, печень, селезенка и др.) обнаружена фосфолипаза Ai (фосфатид-ацилгидролаза, ЕС 3.1.1.4), вызывающая расщепление сложноэфирных связей в положении 1 различных классов фосфоглицеридов. Известно, что фермент проявляет стереоспецифичность, аналогичную фосфолипазе Аг, термически лабилен и имеет pH оптимум при 4,2. [c.271] В значительных количествах в хлоропластах ряда растений (морковь, капуста, шпинат, сахарная свекла) обнаружена фосфолипаза D, которая расщепляет фосфоэфирную связь между фосфатидовой кислотой и гидрофильной компонентой (X), что приводит к образованию фосфатидовой кислоты. [c.272] Замена жирнокислотного остатка на 1-алкенильноэфирную группу в плазмалогенах не изменяет специфичности липолитических ферментов, но существенно отражается на скорости гидролиза. Так, плазмалогены, как правило, расщепляются с меньшей скоростью, чем фосфолипиды ацильного типа [124]. Кроме указанных ферментов, выделены ферментные системы, расщепляющие алкенильноэфирную группу в плазмалогенах. [c.272] Фосфолипаза Аз используется в синтетических целях [125] при получении определенных молекулярных видов фосфолипидов, а также при синтезе образцов с радиоактивной меткой, которые необходимы при проведении различных биохимических исследований. [c.272] Для изучения молекулярных видов фосфолипидов (т. е. фосфолипидов одного типа, отличающихся природой жирных кислот), используют их расщепление фосфолипазой С. Образующиеся при этом 1,2-ди-ацил-5 -глицерины (или их производные) далее разделяют по степени ненасыщенности в слое силикагеля, импрегнированного нитратом серебра. Диглицериды затем обрабатывают панкреатической липазой для определения положения жирных кислот. [c.272] В настоящее время ферментативные методы являются наиболее перспективными и надежными в структурном анализе фосфолипидов. [c.272] Спектры ЯМР до недавнего времени применялись лишь для исследования отдельных фрагментов фосфолипидов, однако в настоящее время их используют для исследования нативных фосфолипидов и даже их комплексов, например с белками. [c.273] Вернуться к основной статье