ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Электрофорез из "Хроматография Практическое приложение метода Часть 1" Интегральные детекторы типа эвдиометра Джанка, принцип работы которых заключается в измерении объема выходящего из колонки газа, к настоящему времени вышли из употребления, а наиболее широкое распространение получили универсальные детекторы — пламенно-ионизационный и детектор по теплопроводности (катарометр). Кроме того, существуют селективные детекторы. Например, детектор по захвату электронов используется для обнаружения соединений, в состав которых входят атомы (в частности, атомы галогенов), сродство которых к электрону выше, чем у ионизованного газа-носителя, а термоионный детектор применяется для обнаружения фосфор-органических соединений. [c.27] Наиболее эффективное сочетание возможностей техники разделения и идентификации веществ достигнуто путем объединения в одну систему газового хроматографа и масс-спектрометра. Такая система называется хроматомасс-спектрометром, а соответствующий метод анализа — хроматомасс- спектромет-рией. Масс-спектрометр способен работать в режиме обнаружения какого-то одного иона или одновременно нескольких ионов, в частности фрагментов молекул. С помощью компьютера можно построить кривую элюирования этих ионов, а также определить состав анализируемого образца и оценить количество каждого компонента, даже если они не полностью разделились. [c.27] Электролит можно стабилизировать в вертикальной колонке путем создания градиента его плотности в направлении от верхнего конца колонки к нижнему, однако обычно неподвижность электролита обеспечивается в результате его абсорбции различными природными или синтетическими полимерами. В соответствии с природой носителя различают методы электрофореза на бумаге, мембранах из ацетилцеллюлозы, в гелях агара или крахмала, полиакриламидном геле и т. п. Электрофоретические методы можно также классифицировать по способу разделения или по типу применяемой аппаратуры (например, колоночный и тонкослойный электрофорез). [c.28] Электрофоретическому разделению веществ мешает их диффузия. Среда, в которой мигрируют молекулы, сама по себе в какой-то мере препятствует диффузии, однако еще в большей степени можно подавить этот эффект и одновременно увеличить подвижность сравнительно небольших молекул с помощью высокого напряжения (высоковольтный электрофорез). В некоторых случаях гели выполняют роль сит. Например, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия разделение предварительно дентурированных белков происходит в соответствии с размерами их молекул. При проведении электрофореза в градиентном геле разделяемые вещества мигрируют в направлении уменьшения диаметра пор геля, и поэтому с увеличением расстояния от старта задерживаются все более мелкие молекулы. [c.28] Плоскостной электрофорез имеет те же преимущества, что и плоскостная хроматография, т. е. позволяет на одной элект-рофореграмме сравнивать одновременно несколько образцов. Методом электрофореза можно, как и в двумерной бумажной или тонкослойной хроматографии, разделять вещества в двух направлениях, в частности в буферах с различным значением pH. Возможен и другой вариант, когда для разделения в двух взаимно перпендикулярных направлениях используют различные носители. Например, сначала проводят электрофорез в узкой полоске агарозного геля, в котором подвижность молекул определяется их зарядом, а затем — в пластинке агарозного геля, в котором вещества разделяются в соответствии с размерами их молекул. Способы качественного и количественного анализа электрофореграмм сходны с используемыми в бумажной и тонкослойной хроматографии. Белки можно обнаруживать также с помощью моноспецифических антител (иммунофиксация). [c.29] В методе иммуноэлектрофореза для определения положения индивидуальных белков на электрофореграмме применяют реакцию преципитации с антисывороткой, помещенной вдоль направления миграции. Более эффективного разделения компонентов можно добиться с помощью метода перекрестного-иммуноэлектрофореза, суть которого сводится к следующему. Узкую полоску геля с разделенными в одном направлении антигенами переносят на пластинку с гелем, содержащим антитела, и проводят дополнительный электрофорез в перпендикулярном направлении. Образующиеся при этом зоны преципитации имеют форму ракет, высоту которых можно использовать для оценки количества антигена (методы электроиммунотестирования и ракетного электрофореза). [c.29] Хроматография, по-видимому, является наиболее универсальным методом разделения веществ. Она применима для разделения смесей любых растворимых или летучих соединений. Вы- бор того или иного метода хроматографии зависит от природы и количества образца, цели разделения, от опытности экспериментатора, а также от того, каким оборудованием он располагает и как скоро необходимо провести разделение. [c.30] ГЖХ (см. гл. 15). Другие газообразные вещества, такие, как. углеводороды, лучше всего разделить при помощи ГЖХ. Метод газовой хроматографии применим и для разделения нелетучих соединений, если их можно превратить в стабильные летучие производные. Несмотря на то что существуют приборы, позволяющие разделять большие количества веществ, газовая хроматография не относится к числу совершенных препаративных методов. Основными достоинствами этого метода являются сравнительно высокая скорость анализа и возможность автоматизировать процесс, а главный недостаток — высокая стоимость, оборудования. В силу последнего обстоятельства финансирование этой области исследований осуществляют в основном нефтеперерабатывающие фирмы, которые могут позволить себе нести большие расходы. [c.31] Теоретически любые растворимые вещества можно разде--лить с помощью подходящего метода жидкостной хроматографии. Ионообменная хроматография и электрофорез применимы в тех случаях, когда соединения имеют ионный характер или содержат ионогенные группы. Область применения гель-хроматографии ограничена соединениями с относительно высокой молекулярной массой (10 —10 дальтон). Адсорбционная и распределительная хроматография используются для разделения веществ со средней молекулярной массой (10 —10 дальтон),. и поэтому эти методы представляют особый интерес для хими-ков-органиков. Небольшие количества веществ можно разделить с помощью различных методов плоскостной хроматографии. Преимуществом последних является возможность анализа одновременно нескольких образцов, а также низкая стоимость, оборудования. Методы плоскостной хроматографии отличаются очень простым аппаратурным оформлением, однако требуют от экспериментатора определенных навыков. Разработано несколько вариантов препаративной плоскостной хроматографии и количественного анализа хроматограмм, однако они в известной степени несовершенны. Современная колоночная хроматография обладает теми же достоинствами и недостатками, что и газовая хроматография, однако в отличие от последней ее можно рекомендовать не только для анализа, но и для препаративного выделения веществ, особенно если эти вещества недостаточно термостойки, разлагаются на свету или легко окисляются. [c.31] Обзоры по отдельным разделам хроматографии публикуются достаточно часто, тем не менее существует ряд вопросов, до-тюлпительное освещение которых было бы весьма полезно. Некоторые из этих вопросов, заслуживающих, на наш взгляд, осо- бого внимания, сформулированы ниже. [c.32] Систематический органический и неорганический анализы. Недалеко то время, когда аналитические схемы идентификации ионов и молекул, которые использовались и продолжают использоваться для обучения студентов, уступят место рациональному применению в педагогической практике таких хроматографических методик, как ТСХ. [c.32] Номенклатура. Необходим критический анализ применяемых в хроматографии терминов. Возможно, это позволит достичь хотя бы некоторой унификации, [5, 69]. [c.32] История совершенствования хроматографического оборудования. Интересно проследить, как совершенствовалась хроматографическая аппаратура. Как, начав с приспособлений, предназначенных совершенно для других целей (например, с гребенок и сушилок для волос, которые вошли в обиход в бумажной хроматографии), хроматографисты создали такое сложное оборудование, как полностью автоматизированная система ТСХ ( hromatape) и система обработки данных хроматомасс-спектрометрии. [c.32] Применение хроматографии в различных областях, таких, как клиническая химия, судебная экспертиза и дистанционный анализ (например, слежение за процессами, связанными с использованием радиоактивных препаратов, или определение состава внеземных объектов). [c.33] Перспективы развития различных типов хроматографии. Несмотря на то что в создании более специфичных сорбентов (по сравнению с предложенными в свое время Полингом [70]) достигнуты значительные успехи, по-видимому, аффинная хроматография будет продолжать развиваться. Быстрыми темпами будет, по-видимому, совершенствоваться и препаративная хроматография (например, центрифужная [18], противоточная 19, 20] и так называемая флип-флопная хроматография 71]). Широкомасштабное использование хроматографии (например, для утилизации следовых количеств примесей или очистки лекарственных препаратов) потребует разработки новых, более рациональных процессов непрерывного разделения. Отчетливо наблюдается тенденция к полной автоматизации качественного и количественного анализа элюатов (использование микропроцессоров). Уже предпринято несколько попыток сконструировать универсальный детектор для жидкостной хроматографии. [c.33] Возможности газовой хроматографии могут быть значительно расширены в результате введения в практику исследований сверхкритической (флюидной) газовой хроматографии [72] и других методов, обеспечивающих селективность подвижной фазы. Многообещающим методом разделения веществ с очень большой молекулярной массой является фрационирование в поле потока. Этот процесс родствен хроматографии, в которой для селективного удерживания веществ используется внешнее поле [73]. Естественно, нельзя исключить, что хроматография и(или) электрофорез будут в конце концов вытеснены ка-ким-то новым методом разделения, однако это вряд ли произойдет в обозримом будущем. [c.33] Как следует из названия главы, в ней рассмотрены методы разделения аминокислот и олигопептидов, причем особое внимание уделено последним достижениям в этой области, а также сравнительно новым методикам. Методы, не претерпевшие существенных изменений со времени выхода в свет последнего издания этой книги [1], либо вообще не упомянуты (электрофорез и ТСХ), либо только дополнены (ионообменная хроматография). Применение рассматриваемых методов в клинической химии обсуждается в недавно опубликованной книге Бремера и др. [2]. [c.37] Метод анализа аминокислот с помощью ионообменной хроматографии базируется на работах Штейна и Мура [3—5], которые систематически изучали проблемы, связанные с разделением и количественным определением наиболее распространенных аминокислот. В 1958 г. эти авторы [5] предложили автоматическую систему, позволяющую проводить полный анализ аминокислот за 24 ч. В дальнейшем эта система неоднократно модифицировалась с целью увеличения скорости и чувствительности анализа. В настоящее время предел обнаружения аминокислот составляет несколько пикомолей, а длительность анализа равна 90 мин. Следует, однако, отметить, что ни одна из современных систем не дает такого высокого разрешения, как система, предложенная Муром и др. [5] . Уменьшение разрешающей способности, которое является следствием увеличения скорости разделения, затрудняет или даже делает невозможным определение малораспространенных аминокислот. [c.37] Вернуться к основной статье