ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Разделение фрагментов ДНК и построение рестрикционных карт (физическое картирование) из "Сельскохозяйственная биотехнология Изд2" Ферменты генетической инженерии — это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т. д. Рассмотрим основные ферменты генетической инженерии. [c.24] соИ или фага Т4. ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5 3 путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи при добавлении фермента к одноцепочечной ДНК-матрице в присутствии праймера произойдет ее удвоение. Это свойство используется, например, при создании кДНК-библиотек. ДНК-полимераза применяется также для заполнения бреши в цепи ДНК, например, при застраивании фрагментов с выступающими 5 -концами. Экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК. [c.24] Использование специфических термостабильных ДНК-полиме-раз — Tth- и Taq-полимераз — выделенных из бактерий, живущих в гейзерах, позволило проводить амплификацию — множественную наработку любого фрагмента ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР, в основу которого положена Г(яд -полимераза, не только упростил некоторые старые методики генной инженерии, но и позволил проводить молекулярное маркирование как отдельных генов, так и целых геномов. [c.24] Нуклеазы — это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нук-леаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке — деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (например, деградация мРНК после трансляции) и защита от чужеродных молекул нуклеиновых кислот (расщепление фаговой ДНК бактериальными нуклеазами при заражении бактерии фагом). [c.25] Нуклеазы по типу их действия можно поделить на группы. Нуклеазы могут действовать только на молекулы ДНК (ДНКазы) или РНК (РНКа-зы), либо на молекулы и ДНК, и РНК одновременно (нуклеаза золотистой фасоли). Нуклеазы избирательно могут действовать на одноцепочечную (нуклеаза S1), или двуцепочечную (экзонуклеаза III) молекулы ДНК, или на гибридную ДНК — РНК-молекулу (рибонуклеаза Н). [c.25] Кроме того, нуклеазы можно разделить на два типа на экзонуклеазы и эндонуклеазы. Экзонуклеазы обычно гидролизуют молекулы с 5 - или 3 -свободных концов, а эндонуклеазы могут расщеплять внутри последовательности фрагмента или кольцевой молекулы ДНК. [c.25] Рестриктазы. Отдельную группу, особенно с утилитарной точки зрения ее применения в генной инженерии, представляют специфические эндонуклеазы — рестриктазы. [c.25] В основе метода, позволившего непосредственно приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. соИ, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на фрагменты ДНК-специфическими ферментами — рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используются около 200. [c.25] Рестриктазы делятся на несколько типов по характеру расщепления нуклеотидной последовательности. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач. Рестриктазы III типа похожи на рестриктазы ] типа, они гидролизуют ДНК на расстоянии 20—35 н. п. от сайтов узнавания и также довольно редко используются практических целей. [c.26] Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые липкие концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты, имеющие тупые концы, могут быть соединены вне зависимости от того, какой рестриктазой они были образованы. Фрагменты с липкими концами более удобны для создания рекомбинантных ДНК, так как ДНК-лигаза обеспечивает беспрепятственное соединение фрагментов. [c.27] Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, которое необходимо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага X при оптимальных условиях. Оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются индивидуальными и зависят от pH, ионной силы, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции. Рестриктазы являются основными ферментами, используемыми в генетической инженерии. [c.27] Ферменты рестрикции стали эффективным инструментом исследова-ния. Они позволяют превращать молекулы ДНК очень большого размера (10 — 10 н. п.) в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до десятков тысяч пар оснований. С помощью метода электрофореза в агарозном геле фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно. Метод электрофореза основан на разделении (фрагментов) молекул ДНК, движущихся с различной скоростью в электрическом поле. В растворе ДНК существует в виде аниона, и при помещении раствора ДНК в электрическое поле молекулы будут двигаться к положительному полюсу (катоду). [c.27] Разделение фрагментов ДНК осуществляют в носителе, которым является раствор полимера агарозы. Отсюда и название метода. Агарозный гель образует трехмерную полимерную ячеистую структуру. Он электронейтрален и химически инертен по отношению к ДНК, поэтому всегда легко можно выделить (элюировать) необходимый фрагмент ДНК из геля с сохранением биологической активности. Использование геля в качестве среды, где проводится электрофорез, позволило решить проблему разделения фрагментов и затем выделения конкретного фрагмента ДНК (рис. 1.1). [c.27] Химический сиквенс основан на избирательной химической деградации нуклеотидов. Он был предложен в 1977 г. А.М. Максамом и В. Гилбертом и назван их именем. Для секвенирования этим методом необходимо получить одноцепочечную молекулу ДНК, один из концов которой метят с помощью изотопа фосфора препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований. Так, например, добавление 60 %-ной муравьиной кислоты разрушает пуриновые основания (А + Г), прибавление диметилсульфата — только гуанидиновые основания чистый гидразин разрушает пиримидиновые основания (Т + Ц), а в присутствии 1,5 М Na l избирательно разрушаются только цитозиновые основания. Очень важно подобрать условия реакции таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. При обработке поврежденных молекул пиперидином в ДНК образуется разрыв в том месте, где находилось разрушенное основание. [c.30] В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу на четырех соседних дорожках в акриламидном геле в денатурирующих условиях затем проводят радиоавтографию, и фрагменты, содержащие радиоактивную метку, оставляют отпечатки на рентгеновской пленке. По их положению можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание — его положение. Так, по набору полос на рентгеновской пленке определяют нуклеотидную последовательность анализируемого фрагмента ДНК. [c.30] С помощью этого метода за короткий срок удалось установить полную нуклеотидную последовательность ДНК SV 40, рекомбинантной плазмиды pBR322 и многих других последовательностей ДНК. Однако секвенирование методом Максама-Гилберта имеет ряд недостатков, связанных с длительностью и значительной трудоемкостью процедур. В настоящее время на основе секвенирования с помощью химической деградации разработаны усовершенствованные и быстрые методы определения нуклеотидной последовательности, в том числе твердофазное секвенирование и секвенирование с использованием обращенно-фазовой хроматографии. [c.30] Так как в основе секвенирования по Сэнгеру лежит процесс репликации ДНК, то основным ферментом является ДНК-полимераза (используют ДНК-полимеразу I). В присутствии одноцепочечной ДНК-матрицы, короткого полинуклеотидного праймера и нуклеотидов по принципу комплементарности будет происходить синтез второй цепи ДНК. При этом удлинение цепи будет проходить до тех пор, пока вместо дезокси-нуклеотида не присоединится дидезоксинуклеотид. Присоединение последнего приведет к остановке синтеза. [c.31] Полученные фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 1.3, б). [c.32] Располагая такой информацией, можно локализовать на ДНК биологически важные участки. Так, например, показано, что репликация вируса SV 40 всегда начинается в одном специфическом Hind Ш-фрагменте и продолжается в обоих направлениях. Рестрикционные карты и рестрикционные фрагменты были также использованы для картирования участков ДНК, на которых синтезируются мРНК для вирусных белков. [c.32] Вернуться к основной статье