ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Идентификация и выделение последовательностей генов из "Сельскохозяйственная биотехнология Изд2" Выделение генов — один из главных этапов в генетической инженерии. Успех на этой стадии создания рекомбинантных ДНК зависит прежде всего от того, насколько изучен данный ген и его положение в геноме донора от разработки методов выделения мРНК данного гена и методов обнаружения функциональной активности продукта данного гена от существования объектов, в которых данный ген находится в больших количествах (амплифицирован) или в которых он особенно активен, что позволяет выделить достаточные количества его мРНК, которые можно в дальнейшем использовать для получения ДНК этого гена путем обратной транскрипции. [c.42] В принципе существуют два основных пути получения гена либо ген искусственно синтезируют, либо из клонотеки отбирают ту рекомбинантную ДНК, которая содержит нужный ген. [c.42] К полученной кДНК присоединяют липкие концы и встраивают в плазмиду, например pU 19. Рекомбинантную ДНК вводят в Е. oli, где кДНК-фрагмент размножается. Подобная схема была использована для получения генов, кодирующих инсулин, гормон роста, интерферон, альбумин, иммуноглобулины и ряд других белков, производство которых уже налажено в промышленных масштабах. [c.44] Для того чтобы убедиться, что получен именно тот ген, который кодирует данный белок, существует несколько методов. Если известна последовательность аминокислот белка, кодируемого геном, то, определив нуклеотидную последовательность клонированной ДНК (см. рис. 1.3), можно убедиться, что она кодирует именно этот белок. [c.44] Идентификация нужного гена из клонотеки. В этом случае задача исследователя сводится к поиску среди миллионов клонов тех, которые содержат фрагмент ДНК с интересующим его геном. В настоящее время для решения такой задачи применяются молекулярные зонды (пробы). Зонд представляет собой меченую молекулу нуклеиновой кислоты, гомологичную последовательности гена. [c.46] Скрининг библиотек. После того как радиоактивный зонд получен, просматривают геномную библиотеку или библиотеку кДНК для идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду и, следовательно, соответствующей анализируемому белку. [c.46] Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47] По полученным на радиоавтографе полосам судят о присутствии анализируемого фрагмента в геноме, изменениях в этой последовательности (делеции, инсерции), а по интенсивности полос можно определить число копий гена в геноме. Таким образом, описанный метод активно используется как для анализа отдельных генов, так и целых геномов. [c.48] методы в том или ином сочетании позволяют получить многие гены, продукты которых — белки — известны и могут быть выделены хотя бы в малом количестве. Эти гены в дальнейшем могут стать объектом генно-инженерных манипуляций, задача которых получить их экспрессию в новом генетическом окружении. [c.48] Вернуться к основной статье