ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Общие сведения Е. И. Филиппович из "Химия биологически активных природных соединений" Изучение денатурации в связи с особенностями конкретных белков имеет большое значение не только при выделении и исследовании биологической роли этих макромолекул, но также и при рассмотрении закономерностей образования их пространственных структур. Такой взгляд был подтвержден многочисленными работами по изучению обратимой денатурации белков . [c.157] Рибонуклеаза содержит в восстановленном состоянии 8 сульфгидрильных групп. Хаотическая, ненаправленная рекомбинация их при окислении может привести к 105 разным пространственным формам, из которых только одна (или несколько) соответствует природному ферментативно активному белку. Высокая степень восстановления биологической активности при реокислении свидетельствует о том, что либо первичная структура однозначно определяет характер вторичной и третичной, так что окисление проходит однозначно, либо возможно суш ествование нескольких пространственных форм рибонуклеазы, которые обладают биологической активностью. Данные хроматографии, рентгеноструктурного анализа и других исследований свидетельствуют в пользу первого предположения. [c.157] современные представления связывают образование вторичной и третичной структуры глобулярных белков с той информацией, которую несет первичная структура белковых цепей в момент биосинтеза белка в клетке Доказательством суш,ествования предпочтительных трехмерных структур является также то, что синтетические полипептиды и белки проявляют биологическую активность (например, АКТГ, инсулин, рибонуклеаза). Но, принимая это положение за основу, нельзя забывать, что в физиологических условиях в процессе выполнения биологических функций могут происходить динамичные обратимые сдвиги в конформации глобулярных белков. Эти сдвиги могут явиться, например, результатом так называемых аллостерических взаимодействий в молекулах ферментов (см. главу Ферменты ). Такая способность к обратимой изменчивости тесно связана с регуляцией активности ферментов, с регуляцией процессов жизнедеятельности на клеточном уровне. [c.157] Малые пептиды в природе встречаются так же часто, как и крупные полипептиды (белки). [c.161] Однако наибольший интерес для исследователя представляют не олигопептиды, а высшие пептиды. Установлением их аминокислотного строения занимаются многие лаборатории мира. Высшими пептидами являются прежде всего пептидные гормоны. Классическим примером служит инсулин, строение которого установлено благодаря работам Сенджера. Пептидные гормоны выделяют из поджелудочной железы, гипофиза, щитовидной железы и из крови Не все из них получены в чистом виде, поэтому говорить об их строении еще рано. Но ряд соединений хорошо изучен и даже получен синтетически (табл. 7). [c.161] Условные обозначения, применяемые для отдельных цепей, были введены Эдсолом и Брандом В цепи А содержится 21, а в цепи В — 30 аминокислотных остатков. [c.163] Затем каждый из полученных полипептидов подвергался частичному гидролизу с целью установления последовательности аминокислот. При этой работе, представление о размерах и трудоемкости которой можно составить из приводимой ниже схемы установления последовательности аминокислот в цепи В инсулина (схема 1), наиболее широко применялся реактив Сенджера — динитрофторбензол. ДНФ-Производные пептидов и аминокислот разделялись с помощью бумажной хроматографии и идентифицировались. [c.163] Кислотный гидролиз инсулина приводит к выделению 6 моль аммиака, что соответствует шести амидным группам аспарагина или глутамина. Чтобы определить их положение в цепях, проводилось восстановление с помощью натрийборгидрида в тетрагидрофуране, при котором (о-карб-оксильные группы аспарагиновой или глутаминовой кислот восстанавливались до спиртовых групп, а амидные группы—СО—КН, аспарагина и глутамина оставались незатронутыми. Присутствие в гидролизате аминоспиртов позволяет судить о количестве и природе дикарбоновых аминокислот. [c.163] Таким образом, было установлено, что инсулин содержит лишь четыре остатка глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты не содержит совсем, но зато в нем имеются три остатка глутамина и три остатка аспарагина. Местоположение остатков аспарагина и глутамина определялось путем специфического ферментативного гидролиза, не затрагивающего ш-амидные связи. Полученные пептиды разделялись электрофорезом. Затем каждый из них был подвергнут кислотному гидролизу. Те пептиды, которые содержали аспарагин или глутамин, при гидролизе дали аммиак. Так было показано, что остатки 5, 15, 18, 21 цепи А и 3, 4 цепи В существуют в амидной форме. [c.163] Более вероятным является, по-видимому, образование антипараллель-ного димера II. [c.166] Синтез такой природной структуры, как молекула инсулина, выдвигает перед исследователями двойную задачу. Во-первых, требуется синтезировать две аминокислотные последовательности в 21 и 30 аминокислотных остатков. При современном уровне развития химии пептидов это можно осуществить с достаточно хорошим выходом. Другая сторона вопроса более сложна. Молекула инсулина содержит 6 остатков цистеина, которые в нативном белке определенным образом скомбинированы и образуют 3 дисульфидных мостика, причем один из них дает внутренний цикл в цепи А (остатки 6 и 11). При рекомбинации теоретически возможно 16 вариантов замыкания дисульфидных мостиков (рис. 26) но, повидимому, лишь единственная комбинация приводит к биологически активной молекуле. Это ставит жесткое условие найти разные типы защит для различных сульфгидрильных групп с тем, чтобы иметь возможность осуществить ступенчатое направленное замыкание определенных пар ЗН-групп. [c.166] В качестве защитных группировок ими были испробованы карбобенз-оксильная, бензилтиометильная и тг-нитрофенильная группировки. Однако оказалось невозможным избежать одновременного снятия всех этих защитных группировок в условиях обработки бромистым водородом в уксусной кислоте. Многочисленные работы по синтезу различных пептидных фрагментов цепей А и В инсулина ничего нового в этом направлении пока ие дали. [c.166] Если структура инсулина правильно отражается формулой, предложенной Сенджером, то синтетически полученные цепи А и В инсулина должны при рекомбинации между собой и с цепями А и В, выделенными из природного белка, вести себя аналогичным образом. [c.167] Таким образом впервые удалось осуществить химический синтез белка природного строения. Тем самым структура инсулина, предложенная Сенджером, получила полное и окончательное подтверждение. [c.169] В последнее время получение инсулина осуществлено также с помощью твердофазного синтеза (см. стр. 130). [c.169] Было установлено что глюкагон представляет собой линейный пептид, содержащий 29 аминокислотных остатков. В глюкагоне, в отличие от инсулина, отсутствуют пролин, изолейцин и цистин, зато имеются остатки триптофана и метионина, которых нет в инсулине. [c.169] Вернуться к основной статье