ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Количественная реакция с нингидрином из "Твердофазный синтез пептидов" Нингидринная реакция применима для количественного определения простых пептидов, пептидов с высоким содержанием лизиновых остатков или длинноцепочечных пептидов после их предварительного быстрого щелочного гидролиза [35]. Для проведения этого гидролиза аликвотные части пептидов в специальных полипропиленовых ампулах упаривают досуха в сушильном шкафу. В каждую ампулу добавляют по 0,15 мл 13,5 и. раствора едкого натра и нагревают ампулы в автоклаве в течение 20 мин нод давлением примерно 1 кг см . После охлаждения щелочь нейтрализуют, добавляя в каждую ампулу по 0,25 мл уксусной кислоты. [c.133] При применении нингидринной реакции для анализа образцов, растворенных в пиридиновых буферах, пиридин необходимо предварительно удалить. В том случае, если образцы были растворены в аммиачных буферах, перед анализом к ним необходимо прибавить едкий натр до сильно щелочной реакции, а затем для удаления аммиака высушить в вакуум-эксикаторе или упарить досуха в сушильном шкафу, после чего нейтрализовать эквивалентным количеством уксусной кислоты. Образцы не должны содержать кислоту или основание в количествах, при которых доведение pH образцов до значения 5 потребовало бы прибавления более мл ц. раствора основания или кислоты, иначе образование окрашенного соединения с нингидрином будет подавляться. [c.133] Реактивы. 1. Буферный раствор на основе ацетата натрия, pH 5,5, 4 М. 2720 г НаООССЫз ЗНгО растворяют при нагревании в 3 л воды. Раствор охлаждают до 25°, добавляют 500 мл уксусной кислоты и разбавляют водой до объема 5 л. Величину pH раствора доводят до 5,51. Полученный буфер хранят при 4° без каких-либо дополнительных предосторожностей. [c.133] ИОДИСТОГО калия допустимо появление лишь светло-желтой окраски). Раствор не следует долго встряхивать или энергично перемешивать, так как при этом гидриндантин будет окисляться воздухом. Затем к раствору добавляют 250 мл реактива 1, в раствор пропускают азот в течение нескольких минут и полученный раствор хранят в темной склянке в атмосфере азота. Реактив пригоден в течение 1 недели. Многие исследователи считают более удобным каждый раз получать свежую порцию реактива, избегая хлопот, связанных с пропусканием азота в раствор реактива и его хранением. Для облегчения приготовления реактива можно сделать таблицу, показываюшую необходимые количества компонентов для получения различных объемов реактива. [c.134] Методика. Для фракций объемом 1 или 2 мл берут 1 мл реактива 2. Нейтрализации не требуется, если при доведении pH до величины 4—6 применяют менее 1 мл 0,1 н. раствора едкого натра или соляной кислоты. После добавления реактива раствор осторожно перемешивают в пробирке, неплотно закрывают ее пробкой, нагревают 15 мин на кипящей водяной бане и немедленно охлаждают. В пробирку добавляют 5 мл 50%-ного спирта и энергично перемешивают содержимое встряхиванием, чтобы окислить воздухом оставшийся гидриндантин (это обеспечивает в дальнейшем большую стабильность базовой линии). Затем измеряют поглощение раствора при 570 нм, за исключением тех случаев, когда пептид имеет на Ы-конце пролин или оксипролин в этом случае поглощение измеряют при 440 нм или при другой длине волны. В качестве стандарта используют раствор лейцина с концентрацией 50 мкг мл-, 0,2 мл этого раствора дают величину поглощения в 0,2 единицы оптической плотности. [c.134] Вернуться к основной статье