ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Физические и химические свойства и структурные особенности некоторых хорошо изученных гликопротеинов из "Гликопротеины Том 2" После кристаллизации вещество растворяют в небольшом объеме воды и все ионы аммония удаляют диализом при 4° против дистиллированной воды. Оставшийся раствор замораживают, высушивают и сохраняют в виде белого порошка. При такой обработке небольшое количество белка денатурируется, поэтому раствор, приготовленный из высушенного замораживанием препарата, слегка опалесцирует. Денатурированный белок можно получить иным путем, а именно выливанием раствора белка при температуре около 90° в воду при помешивании (воды приблизительно в 5 раз больше, чем белка) или в охлажденный метанол (примерно 5 объемов). Полученные таким путем препараты фильтруют, промывают водой и этанолом и высушивают эфиром. [c.8] Во всех случаях высушенный белок оставляют на воздухе для уравновешивания его влажности с влажностью среды. Анализ полученного белка на азот проводят одновременно с анализом на влажность (белок высушивают до постоянного веса при 100—105°) и на золу (белок доводят до постоянного веса при 550—600° [7]). Безводный белок гигроскопичен. [c.8] Иногда яичный альбумин кристаллизуют из растворов сульфата натрия [8]. Раствор сульфата натрия приготовляют растворением 400 г безводной соли в 1 л теплой воды этот раствор (36,7 г сульфата натрия на 100 мл раствора) необходимо хранить при температуре выше 30°, чтобы предотвратить выпадение кристаллов соли. Равные объемы яичного белка с разрушенными мебранами и раствора сульфата натрия сливают вместе и осторожно перемешивают в течение примерно 15 мин. Осадок удаляют центрифугированием после полного осаждения (примерно через 2 час). К надосадочной жидкости при постоянном перемешивании добавляют 0,2 н. серную кислоту до pH около 4,8. Перемешивание продолжают и к смеси добавляют твердый сульфат натрия до возникновения устойчивой опалесценции. Когда кристаллизация белка станет отчетливо заметной, смесь декантируют от оставшихся твердых частиц сульфата натрия и оставляют не менее чем на 18 час. Весь процесс необходимо проводить при температуре не ниже 20°. [c.8] Образовавшиеся кристаллы после фильтрования или центрифугирования вновь растворяют в объеме воды, равном первоначальному объему яичного белка. Перекристаллизацию проводят путем добавления твердого сульфата натрия при перемешивании. На каждый литр раствора необходимо около 140—180 г безводной соли. Эту обработку яичного белка повторяют еще два или три раза. Окончательно образовавшийся осадок рассыпают тонким слоем и высушивают в теплом помещении. Таким путем получают сухой порошок, в котором белок частично денатурирован. При другом способе обработки белок растворяют в небольшом объеме воды и оставляют в холодной комнате на ночь при этом большая часть сульфата натрия выпадает в виде кристаллов. Надосадочную жидкость собирают, диализуют и затем высушивают в замороженном состоянии или денатурируют описанным выше методом. [c.8] Молекулярный вес яичного альбумина равен примерно 45 ООО [3]. Эта средняя величина подучена измерением осмотического давления, светорассеяния и поверхностного натяжения в мономолекулярном слое. [c.9] Содержание азота и серы в белке равно соответственно 15,76% (507 атомов на 45 ООО 3 белка [9, 7J) и 1,61% (22—23 атома [10—12]). Эти величины согласуются с аналитическими данными, полученными экспериментальным путем для компонентов белка (табл. 1). Содержание фосфора в кристаллическом белке варьирует в больших пределах в ранних работах были приведены величины от 1,75 до 1,89 атома на 45 ООО г для различных препаратов ([9, 13], см. также раздел 7). [c.9] Данные Тристрама и Смита [15], за исключением тех случаев, где указаны ссылки. [c.9] Феволд [2] в своей работе суммировал большую часть из ранее полученных данных по аминокислотному составу яичного альбумина, а Тристрам [14], см. также [15]) составил таблицы наиболее вероятных результатов из сообщений ряда исследователей, использовавших микробиологические или различные хроматографические методы для анализа белковых гидролизатов. В основном гидролиз проводили в одинаковых условиях. Хабиб [16] анализировал гидролизат яичного альбумина (полученный в 6 н. соляной кислоте при 105° в течение 24 час) методом хроматографии по Муру и Стейну и получил величины, в общем близкие к данным, приведенным в табл. 1, хотя в отличие от них он обнаружил 49 остатков глутаминовой кислоты и 32 остатка валина на 45 ООО г белка. Значения для серина и треонина были ниже, чем в табл. 1 (27 и 13 остатков соответственно), но в работе Хабиба г з была введена поправка на потери при гидролизе. Очевидно, этот белок необходимо анализировать методом Мура и Стейна после гидролиза в течение различного времени [15]. [c.10] Количество амидного азота белка определяли методом, с помощью которого можно было учесть содержание в белке аминосахара (том 1, гл. 6). В литературе сообщалось о величине амидного азота в альбумине, равной 31 1 [17] и 29,7 остатков на 45 ООО г белка [18]. В эту величину входят карбоксамидные остатки, образующие углевод-пептидную связь (том 1, 1 л. 10). Характер распределения амидных групп между остатками аспарагиновой и глутаминовой кислот остается неизвестным. [c.10] Лучше изучен аминокислотный состав боковых цепей недеградированного белка. Потенциометрическим титрованием обнаружено присутствие 51 потенциально отрицательно заряженных групп (карбоксильные и фосфатные остатки) 5 групп, титрующихся в участке расположения имидазольной группы 22 остатка лизина и 14 гуанидиновых групп, что находится в хорошем соответствии с аналитическими данными [19]. Была исследована ионизация остатков тирозина измерением поглощения в ультрафиолетовой области при различных величинах pH. Тирозиновые остатки инсулина ионизируются при величине pH немного выше 10, в то время как тирозиновые остатки нативного яичного альбумина не ионизируются при pH 12. При pH около 12,5 происходят быстрые и необратимые изменения фенольные группы ионизируются и остаются в ионизированном состоянии даже тогда, когда pH повторно сдвигается в область ниже 12. При этом белок денатурируется. Более того, яичный альбумин, который денатурируют другими методами, содержит остатки тирозина в ионизированном состоянии при pH ниже 12 [20]. Причина этого явления, наблюдаемого как для альбумина, так и для некоторых других белков [21], пока не ясна. Водородные связи фенольных гидроксильных групп с другими группами внутри молекулы могут быть необходимы для поддержания четвертичной структуры нативного белка [22]. С другой стороны, непосредственное окружение фенольных групп внутри молекулы может быть сильно изменено денатурацией [20]. Некоторые из боковых групп нативного белка недоступны для действия химических реагентов. Как можно было ожидать, остатки тирозина легко реагируют с кетонами только после денатурирования белка [23]. Из общего числа е-аминогрупп альбумина, равного 20, только три группы реагируют с 1-фтор-2,4-динитробензолом в условиях, когда белок не денатурирован [24]. [c.10] И сотрудники разработали метод, при помощи которого как дисульфидная, так и сульфгидрильная сера специфично превращается в сероводород при нагревании белка с гидразином. Образовавшийся сероводород определяют колориметрически. Были получены значения, равные 0,52% (7,3 атома [26]) и 0,48% (6,7 атома [27]). Величина, равная 7 остаткам цистина или цистеина, также может быть найдена при вычислении разности между содержанием общей серы и найденным числом остатков метионина. Большое число исследований было направлено на выяснение распределения этих остатков между сульфгидрильными и дисульфидными группами [28]. [c.11] Было установлено, что яичный альбумин не содержит ни фукозы, ни сиаловой кислоты [73]. Поэтому наиболее вероятно, что углеводная часть яичного альбумина состоит из 2% маннозы и 1,2% глюкозамина или соответственно из 5 и 3 остатков этих сахаров. Данные анализа и кривые титрования [17, 73, 74, 58, 59] показывают, что все три остатка глюкозамина К-ацети-лированы. В соответствии с этими выводами находятся данные о молекулярных весах гликопептидов, выделенных из белка (см. раздел 6). Характер присоединения углевода к пептидной цепи подробно обсуждается в гл. 10 (том 1). [c.13] Из альбумина куриного яйца были получены гликопептиды [51, 75, 74, 65, 58, 76, 69]. Метод получения гликопептидов состоял в выделении образовавшихся при протеолизе гликопептидов различными способами фракционирования с помощью растворителей, а также путем хроматографии. Было показано, что аспарагиновая кислота непосредственно связана с углеводной частью (см. том 1, гл. 10), однако возникли затруднения при получении гликопептида, который содержит аспарагиновую кислоту как единственный аминокислотный остаток (см. том 1, гл. 9). Для получения гликопептида (выход 80—90%), содержащего аспарагиновую кислоту как единственный аминокислотный остаток, была использована следующая методика. [c.13] Вернуться к основной статье