ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Список авторов из "Новое в клонировании ДНК Методы" Уже давно известно, что многие бактериофаги Е. соЫ кодируют РНК-полимеразы, способные взаимодействовать лишь со специфическими промоторами фаговой ДНК- Фаги Т7 и ТЗ — первые тому примеры [1], а относительно недавно полимераза с подобными свойствами была обнаружена и у фага SP6 Salmonella typhlmurium [2]. [c.12] Первым ферментом, широко использовавшимся для синтеза РНК-зондов, стала РНК-полимераза фага SP6 [4]. Это в основном было обусловлено исключительно высокой стабильностью фермента и возможностью получать его в больших количествах с помощью простых методов — в отличие от ферментов фагов Т7 и ТЗ. Однако генетическая организация фагов Т7 и ТЗ исследована достаточно полно, что дало возможность получить их ферменты путем экспрессии клонированных генов, и сейчас они легко доступны. Принцип использования фаговых РНК-полимераз идентичен для всех трех ферментов (рис. 1.1). Обычно полимеразы применяются для транскрипции линейных матриц, но существует и другой подход, основанный на таком природном свойстве этих ферментов, как преждевременная тер-минацня цепи в присутствии низкой концентрации нуклеозид-трифосфатов. Достоинство этого подхода состоит в том, что он не требует линейной матрицы, однако получаемые при этом молекулы-зонды имеют разную длину, что делает их непригодными для работы при использовании приводимых здесь методик. [c.13] РНК-зонды обладают всеми преимуществами одноцепочечных ДНК-зондов это отсутствие конкурентной гибридизации молекул зонда друг с другом, высокая удельная радиоактивность по сравнению с продуктом ник-трансляции и не представляющее трудностей определение длины молекул. Дополнительное преимущество этих зондов по сравнению с одноцепочечной ДНК — большая простота их получения. Транскрипты можно отделить от матрицы путем ее ДНКазного расщепления и фенольной экстракции, тогда как получение одноцепочечных ДНК-зондов требует более трудоемкой процедуры выделения их из геля. В то же время РНК-зонды в большей степени подвержены деградации, чем соответствующие им ДНК-зонды, и об этом нельзя забывать. Самая распространенная проблема, встающая при использовании РНК-зондов, — неоднозначность интерпретации в случае получения отрицательного результата. [c.13] В настоящее время известно. множество векторов, содержащих промоторы для РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ в комбинации с различными последовательностями. Данные о наиболее распространенных плазмидных векторах приведены на рис. 1.2. Выбор вектора — это в известной мере дело вкуса исследователя, хотя при этом могут учитываться и некоторые другие факторы. [c.16] В заключение отметим, что нуклеотидные последовательности большинства векторов известны, и если возникает необходимость использовать зонды для гибридизации с другими плазмидами, следует убедиться в том, что последовательное 1ь полимера не будет вступать в перекрестную гибридизацию с другими плазмидами. [c.17] Для ограничения длины матричного фрагмента можно использовать любую рестриктазу. Необходимо соблюдать лишь одно условие выбранный фермент не должен вносить разрыв между промоторным сайтом инициации транскрипции и встроенной ДНК. Не имеет значения, образуется ли под действием рестриктазы один фрагмент или несколько — транскрибироваться будет только фрагмент, содержащий промотор. [c.18] Если известна подробная рестрикционная карта клонированной последовательности, то набор линейных матриц, полученных разрезанием этой последовательности по разным сайтам, позволяет получить ряд последовательно удлиняющихся зондов. Их можно использовать для построения транскрипционной карты клонирования последовательности. [c.18] Крайне важно, чтобы матричная ДНК была полностью линеаризована, поскольку сверхспирализованные ДНК — эффективные матрицы для всех фаговых РНК-полимераз и на них синтезируются очень длинные транскрипты. Это снижает выход транскриптов требуемого размера и, кроме того, может существенно снизить специфичность зондов, получаемых в реакциях, содержащих смеси молекул. [c.20] Метод получения высокоспецифичных полноразмерных РНК-зондов приведен в табл. 1.2, а метод определения включения нуклеозидтрифосфатов в РНК — в табл. 1.3. [c.21] РНК-полимераза фагов SP6 или Т7. [c.22] НО возможную удельную радиоактивность продукта и в то же время свести к минимуму преждевременную терминацию транскрипции. [c.23] Вернуться к основной статье