ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Выделение ДНК, иммобилизованной на FTA Gene Guard системе с помощью ионообменной смолы helex 100 и протеиназы из "Подготовка биологического материала лдя молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел" Молекулярно-генетический анализ крови является одним из самых распространенных лабораторных исследований при идентификации личности, в экспертизе спорного отцовства, материнства и замены детей. [c.83] Кровь представляет собой вязкую жидкость красного цвета со средней плотностью р = 1,057 г/см . Кровь состоит из межклеточного вещества — плазмы крови и взвешенных в ней форменных элементов эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов (рис. 1). Эритроциты человека представляют собой безъядерные клетки, утратившие в процессе фило— и онтогенеза ядро и большинство органелл, в том числе и митохондрии, и поэтому для молекулярно-генетического анализа эритроциты не представляют интереса. Тем не менее, содержащийся в них гемоглобин и продукты его деструкции, вплоть до гемина, в присутствии молекулярного кислорода, являются потенциальными центрами радикалообразо-вания и ингибиторами Тад-полимеразы. Поэтому при выделении ДНК из крови необходимо большое внимание уделять степени очистки проб от геминовых дериватов. [c.83] Рисунок 2. Форменные элементы крови (по Елисееву В.Г., 1970). [c.84] Несмотря на то, что наряду со зрелыми эритроцитами в нормальной крови содержится 1 — 5% ретикулоцитов, эти клетки, вследствие отсутствия ядра и митохондрий (митохондрии редуцированы), также не представляют интереса для молекулярно-генетической идентификации личности. [c.85] В крови взрослого человека до 65-75% от общего состава лейкоцитов составляют нейтрофи-лы. Эти клетки содержат ядро, в их цитоплазме имеются все виды общих органелл, включая митохондрии. [c.86] Другая большая группа — агранулоциты, в большинстве своем представлена лимфоцитами, содержание которых в крови взрослых людей составляет 20-35%. Эти клетки также содержат ядро и несколько митохондрий. [c.86] Кровяные пластинки, или тромбоциты, представляют собой отделившиеся от гигантских клеток костного мозга — мегакариоцитов, безъядерные фрагменты цитоплазмы. Их количество в 1 мкл крови колеблется от 250 до 350 тысяч. Эти форменные элементы содержат 1-2 митохондрии, тем самым представляют интерес с точки зрения идентификации по прямым мат-рилинейным родственникам. [c.86] Оценить количество ядерной ДНК в 1 мкл крови человека. [c.87] Исходные данные масса диплоидного генома равна тяднк = 5,7 пг, содержание ядерных клеток в крови Ся кл 8000 кл/мм . [c.87] Для проведения ПЦР по ядерным локусам необходимо в среднем 1-10 нг ДНК. Таким образом, 1 мкл крови теоретически достаточно для проведения 46-ти амплификаций. [c.87] Оценить минимальное количество митохондриальной ДНК в 1 мкл крови человека. [c.87] Основная масса митохондриального генома крови приходится на тромбоциты. Предположим, что среднее количество митохондрий на один лейкоцит равно 10, а в тромбоците содержится не менее 2-х митохондрий в каждой митохондрии содержится до 10-ти молекул мтДНК. [c.87] Таким образом, минимальное количество митохондриальной ДНК в 1 мкл крови человека составляет 110 пг. Учитывая то, что для проведения сиквенс-анализа гипервариабельных регионов В-петли необходимо менее 100 молекул мтДНК, данного количества теоретически достаточно для постановки более чем 100 тысяч реакций ферментативной амплификации. [c.88] Рисунок 4. Обратная сторона РТА (РИг,со) карты. Здесь заносятся данные о доноре фамилия, имя, отчество, дата взятия крови, дата рождения. [c.90] Карточки FTA с системой защиты гена — безопасная и удобная система для сбора, транспортировки и хранения образцов крови и других биологических жидкостей. FTA-карточки состоят из фильтровальной бумаги, обработанной буфером, содержащим мощные денатурирующие вещества, предотвращающие рост бактерий и других микроорганизмов, а также защищающие ДНК от действия нуклеаз, окисления и УФ повреждений. После специальной обработки FTA-карты с нанесенным биологическим материалом происходит разрушение клеточных мембран и высвобождение ДНК из органелл и ее прочное связывание с FTA-матриксом (рис. 5 и 6). [c.91] Вернуться к основной статье