ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Количественная оценка выделенной ДНК на флуориметре из "Подготовка биологического материала лдя молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел" В присутствии ДНК у бисбензимида (общеизвестен как краситель Hoe hst 33258 или Н 33258 (рис. 19)) изменяются параметры флуоресценции, интенсивность которой пропорциональна концентрации ДНК. [c.183] Раствор ДНК, концентрацией 1-100 нг/мкл. [c.183] В отсутствие ДНК максимум поглощения и эмиссии Hoe hst 33258 составляет 356 и 492 нм, соответственно. При взаимодействии Н 33258 с ДНК эти пики сдвигаются в область 365 нм (поглощение) и 458 нм (эмиссия). В кювете флуо-риметра комплекс ДНК и Н 33258 облучают ртутной лампой со световым фильтром на 365 7 нм. [c.183] Свет такой интенсивности возбуждает валентные электроны комплекса ДНК — Н 33258, вызывая развитие флуоресценции. Световой фильтр перед фотодетектором позволяет регистрировать эмиссию в области 4б0 15 нм. Таким образом, по интенсивности флуоресценции (по калибровочной кривой или по сравнению с образцом ДНК с известной концентрацией) можно определить концентрацию ДНК. [c.184] Спектрофотометрия растворов ДНК при длинах волн 260 и 280 нм дает некорректные результаты в присутствии РНК и белков, вследствие наложения их спектров. Hoe hst 33258 связывается только с двухцепочечной ДНК, что позволяет корректно измерять концентрацию ДНК в присутствии белковых и РНКовых контаминантов. [c.184] С повышением концентрации детергентов флуоресценция усиливается. Конечная концентрация SDS должна быть ниже 0,01%, Тритона Х-100 — ниже 0,001%, других детергентов — ниже 10 мкг/мл. Флуоресценция одноцепочечной геномной ДНК примерно вполовину менее интенсивна по сравнению с двухцепочечной ДНК эквивалентной концентрации. Поэтому при измерении концентрации одноцепочечной ДНК стандартная ДНК тоже должна быть одноцепочечной. Если проба содержит высокий уровень белков, которые могут увеличивать уровень шумов, предварительная обработка пробы Протеиназой К может снизить флуоресцентный фон. [c.184] Так как Н 33258 связывается с А —Т основаниями двойной спирали ДНК, интенсивность сигнала флуоресценции зависит не только от концентрации ДНК, но и от процентного содержания АТ в ней. Поэтому необходимо убедиться, что АТ-состав стандартной ДНК близок к таковому в биологическом объекте. Обычно при измерении ДНК эукариот, в которых АТ-состав колеблется от 56 до 60%, в качестве стандарта наиболее приемлема ДНК тимуса теленка с содержанием А —Т пар 58%. Ниже приведен процентный состав А —Т пар в ДНК некоторых организмов. [c.185] Вернуться к основной статье