ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Выделение эритроцитарных мембран из "Биологические мембраны Структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами" Липиды в мембранах эритроцитов находятся почти исключительно в форме бислоя. По данным ЯМР, в эритроцитах человека таких липидов не менее 97 %. Вязкость липидного бислоя мембран эритроцитов выше, чем для других мембран. Это обусловлено высоким содержанием в них холестерина. В табл. 2—4 Приложения дана подробная количественная характеристика состава липидов и фосфолипидов мембран эритроцитов млекопитающих, а также жирнокислотного состава фосфолипидов в эритроцитах человека и быка. [c.231] Материалы и оборудование кровь доноров с антикоагулянтом, хлорид натрия, трисгидроксиметиламинометан (трис), соляная кислота, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), центрифужные пробирки, центрифужные весы, центрифуга МР -360, центрифуга ЦЛР-1.У 4.2, рН-метр, пастеровские пипетки, фильтровальная бумага. [c.231] В экспериментах использовать свежеприготовленную суспензию мембран. [c.232] Такие медные комплексы обладают преимущественно фиолетовой и синей окраской. [c.233] Реактив Фолина готовят следующим образом 100 г вольфра-мата натрия и 25 г молибдата натрия растворяют в 700 мл воды в круглодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным холодильником Либиха. Прибавляют 50 мл 80 %-ной фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Помещают в колбу несколько капилляров. Смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 10 ч. Далее прибавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и несколько капель брома. Для удаления избытка брома кипятят содержимое колбы в течение 15 мин без обратного холодильника под тягой. Раствор охлаждают, доводят водой до 1 л и пропускают через стеклянный фильтр. Реактив Фолина хранят в химической посуде из темного стекла. На всех этапах приготовления реактива цвет реакционной смеси должен быть желтым. Реактив Фолина титруют 1 н раствором щелочи и на основании полученных данных рассчитывают его кислотность. Перед использованием реактив Фолина разбавляют водой до кислотности, соответствующей 1 н раствору соляной кислоты. [c.234] Далее готовят рабочий раствор в цилиндр на 100 мл наливают 50 мл 2 %-ного раствора Nag Og, в отдельную пробирку — 0,5мл 2 %-ного тартрата натрия и 0,5 мл 1 %-ного сульфата меди. Содержимое пробирки выливают в цилиндр и образовавшейся смесью ополаскивают пробирку и опять выливают в цилиндр. Смесь перемешивают и оставляют на 10 мин. [c.234] Материалы и оборудование сульфат меди, гидроксид натрия, хлорид натрия, тартрат натрия-калия, йодид калия, бычий сывороточный альбумин, суспензия мембран, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, стеклянные кюветы для КФК, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага. [c.235] Для приготовления биуретового реактива в мерную посуду на 250 мл вносят 0,375 г сульфата меди 1,5 г тартрата натрия-калия и растворяют в 150 мл воды. При энергичном перемешивании добавляют 75 мл 10 %-ного раствора НаОН и 1 г йодида калия и доводят содержимое до 250 мл водой. Реактив хранят в полиэтиленовом сосуде, покрытом изнутри парафином, так как он не подлежит длительному хранению. [c.235] В пробирки помещают по 0,2 мл исследуемого раствора, содержащего белок, доводят бидистиллированной водой до 1 мл, добавляют 4 мл биуретового реактива и перемешивают. В контрольную пробирку вместо белка наливают воду. Через 30 мин измеряют оптическую плотность проб (развивается сине-фиолетовое окрашивание за счет пептидных связей) при длинах волн 540—650 нм против контроля (для более точного определения зарегистрировать спектр поглощения проб и выявить против контрольного раствора). [c.235] Содержимое белка в пробах определяют по калибровочному графику с использованием бычьего сывороточного альбумина. Стандартные растворы бычьего сывороточного альбумина должны содержать от 1 до 10 мг белка в 1 мл 1 %-ного раствора хлорида натрия. Определение ведут так же, как в случае опытных проб. [c.236] Для исследования отдельных свойств нативных мембран клеток, а также для изучения молекулярных механизмов регулирования метаболических процессов, осуществляющихся с участием мембранных компонентов клетки, используются различные физико-химические методы модификации мембран. [c.236] Синтетические биологически активные вещества используют для индукции проницаемости природных и искусственных мембран. К ним относятся ионофоры (валиномицин, обеспечивающий проникновение ионов калия через мембрану крауны — мак-роциклические полиэфиры, обеспечивающие проницаемость мембран для ионов натрия, кальция, магния) и каналообразователи (например, аламетицин, способствующий проникновению через мембрану АТР). [c.236] К физическим методам модификации липидных и белковых компонентов биомембран относят ионизирующее и УФ-излучение, температуру. [c.236] Материалы и оборудование 2 моль/л раствор солянокислого гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приготовленный на ОД моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кислоты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага. [c.237] Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе 1. [c.237] В контрольную и опытную пробирки налить соответственно по 1 мл бидистиллированной воды и суспензии мембран эритроцитов. Затем добавить в них по 2 мл 2,5 ммоль/л раствора ацетилхолинхлорида и поместить пробирки в термостат при 3 7 С на 15 мин. После термостатирования прилить по 1 мл раствора щелочного гидроксиламина (готовят перед употреблением путем смешивания равных объемов раствора солянокислого гидроксиламина и гидроксида натрия). Через 15 мин в опытную и контрольную пробы добавить по 2 мл раствора соляной кислоты и по 2 мл раствора хлорного железа. Через 20 мин оптическую плотность опытной и контрольной проб измерить на фотоэлектроколориметре против раствора сравнения. Для расчета активности фермента из величины оптической плотности контрольной пробы вычитают величину оптической плотности опытной пробы. Активность ацетилхолинэстеразы выражают в ммоль/л ацетилхолина с использованием калибровочного графика. [c.238] Материалы и оборудование 2 моль/л раствор солянокислого гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приготовленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кислоты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, установка для УФ-облучения, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага. [c.238] Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе 1. [c.238] Вернуться к основной статье