ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Теория электрофореза в полиакриламидном геле из "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" Для получения полиакриламидного геля используют акриламид и какой-либо агент, образующий поперечные сшивки, — обычно Ы,Ы -метиленбисакриламид (сокращенно б с-акриламид). Реакцию проводят в присутствии катализаторов и инициаторов. В ходе ее происходит винильная полимеризация (рис. 28), приводящая к формированию геля с хаотически свернутой структурой. [c.74] И физические свойства геля. Дэвис [281] исследовал гели, содержавшие от 1,5 до 60% акриламида и от О до 0,625% бис-акриламида, и установил, что при получении гелей для электрофореза необходимо соблюдать следующее правило чем выше концентрация акриламида, тем ниже должна быть концентрация б с-акриламида, и наоборот. Одновременное увеличение содержания обоих компонентов приводит к образованию гелей с повышенной жесткостью и хрупкостью, а одновременное снижение — к возрастанию мягкости и эластичности. В общем случае для гелей с концентрацией 5—15% Т рекомендуется выбирать С в пределах 2—4%. [c.75] Изучение строения полиакриламидных гелей с помощью сканирующего электронного микроскопа [1119] показало, что ячеистая структура геля становится различимой при концентрациях 4% Т и 0,2—5% С. Повышение содержания мономера сопровождается увеличением количества структурированной массы на единицу площади и возрастанием толщины мембран геля. В отсутствие агента, образующего поперечные сшивки, в геле обнаруживаются длинные тонкие волокна, расположенные только в продольном направлении. При содержании С выше 5% структурная организация становится менее выраженной, а примерно при 10% С на микрофотографиях появляются изображения структур, похожих на луковицы и, возможно, соответствующих кластерам, о существовании которых высказали предположение Родбард и др. [1109]. [c.76] Персульфат аммония нестоек в водном растворе, поэтому было предложено [229] заменить его персульфатом калия. [c.77] Процесс полимеризации требует наличия свободных радикалов мономера, которые образуются при основном катализе пот действием свободных радикалов кислорода, выделяемых персульфатом. Поскольку для реакции необходимо свободное основание, полимеризация не идет при низких значениях pH. Если же требуется гель в буфере с низким pH, то полимеризацию следует проводить либо по методу Йордана и Реймонда [644], либо при более высоких значениях pH, а необходимый буфер можно ввести потом в гель путем диффузии или электрофореза. Молекулярный кислород замедляет или вовсе предотвращает полимеризацию, поэтому для получения воспроизводимых результатов его необходимо удалять. Это явление было даже использовано для измерения содержания кислорода в крови [390]. Наличие примесей в реактивах, а также тем пература, при которой проводят реакцию, тоже влияют на скорость полимеризации. [c.77] Фотополимеризацию акриламида осуществляют в присутствии рибофлавина и ТЕМЭД. По сравнению с другими красителями рибофлавин обладает уникальным свойством, заключающимся в том, что входящий в его состав рибозный остаток действует как внутрен ний восстанавливающий агент. В отличие от химической полимеризации фотохимическая реакция требует наличия в С реде следов молекулярного кислорода (около 1 % газовой смеси). Возбужденный светом краситель в при- сутствии донора водорода подвергается восстановлению, а молекулярный кислород окисляет эту восстановленную форму рибофлавина, которая в свою очередь участвует в образовании веществ, необходимых для инициирования полимеризации акриламида [947]. [c.77] В растворах мономеров могут находиться различные буферные ионы, а также такие денатурирующие агенты, как мочевина, ДСН или другие детергенты. Все эти соединения обычно либо сов1сем не влияют на образование геля, либо дишь слегка изменяют время его застывания. [c.77] Полиакриламидный гель служит при электрофорезе не только поддерживающей средой, но и сам принимает активное участие в процессе разделения макромолекул благодаря так называемому эффекту молекулярного сита. Многими экспериментами было доказано, что чем выше концентрация акриламида, тем 1 еньше средний размер пор в геле. [c.78] Для расчета размера пор в полиакриламидном геле можно использовать также уравнение Смитиса [1201], выведенное им ранее для определения зависимости размера пор от концентрации крахмала (см. гл. 1.10). [c.78] Обычно определение размера пор производят на основе электрофоретического или хроматографического исследования белков или нуклеиновых кислот [366, 1087, 1296]. Но поскольку конформация этих макромолекул точно не известна, расчеты, основанные а изучении их поведения, могут оказаться ошибочными. К тому же нельзя пренебрегать и влиянием б с-акрил-амида на средний радиус пор [131, 366, 538, 1109] (рис. 29). [c.78] Исходя из анализа большого числа работ, можно сделать вывод, что в настоящее время нет такой математической формулы, которая могла бы точно описать зависимость между концентрацией акриламида и плотностью геля. [c.78] Однако при этом не слв дует исключать возможности того, что в процессе электрофореза макромолекулы способны изгибать волокна геля, так как белки, обладающие весьма малой скоростью диффузии в гелях, быстро проходят через них под действием электрического поля [449]. [c.80] Как уже отмечалось выше, изучая подвижность макромолекул, нельзя не учитывать содержания бмс-акриламида в геле. Родбард и др. [1109] детально исследовали, как изменяется график Фергюсона в зависимости от концентрации б с-акрил-амида в гелях, содержащих 7,5% Г. На рис. 32 показано, что величина /Сг возрастает с повышением С до 5—87о, после чего падает. При значениях С от 10 до 50% Кт для всех белков асимптотически приближается к нулю. Величина i/o имеет максимум также при концентрации С около 10%, а при более вы-сО К их концентрациях достигает плато на уровне, характерном для каждого отдельного белка, причем этот уровень во всех случаях ниже значения Uo, полученного экстраполяцией соответствующей кривой к нулевой концентрации С (рис. 33). [c.82] Различия между белками с одинаковыми или разными зарядами и(или) размерами, Хедрик и Смит [538] подробно исследовали белки методом электрофореза в полиакриламидном геле и пришли к заключению, что график Фергюсона дает важные сведения о заряде и размерах белковых молекул. Если на этом графике прямые для разных белков параллельны, т. е. значения i/o-различны, а значения Кт равны, то белки имеют оди-нако вые молекулярные массы, но различаются по заряду (рис. 34). С другой стороны, если значения Uo одинаковы, а значения Кт разные, то белки характеризуются одним и тем же зарядом, но разными молекулярными массами (рис. [c.82] Результаты, получеиные из анализа графика Фергюсона, позволяют выбрать наиболее перспективный метод для разделения компонентов данной смеси. Если мы имеем дело с изомерами, имеющими одинаковые размеры, то следует применягь. методы разделения по заряду, например электрофорез или понообмениую хроматографию. Если же молекулы различаются-по размеру, но не по заряду, то целесообразно использовать гель-фильтрацию или препаративный электрофорез в полиакриламидном геле, основанные на эффекте молекулярного сита. Метод анализа соотношений размер — заряд у белков был распространен также и на случаи связывания ими лигандов [539]. [c.85] Как отмечено выше, при электрофорезе в полиакриламидном геле компоненты разделяются одновременно и по размеру, и по заряду. Даже если препарат обнаруживает в полиакриламидном геле только одну полосу, это вовсе не исключает возможности того, что он содержит более одного компонента. Нап ример, крупная молекула с большим зарядом будет-двигаться с такой же скоростью, как и слабо заряженная молекула малых размеров. В результате получится лишь одна полоса. Поэтому для проверки чистоты препарата его необходимо исследовать при нескольких концентрациях геля и различных условиях проведения опыта (разных значениях pH). [c.85] Вернуться к основной статье