ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы определения молекулярной массы мономеров из "Практическая химия белка" Молекулярную массу можно найти по данным количественного анализа Ы-концевых аминокислот (разд. 1.3,1.4). По расходу материала (количество образца) этот метод эквивалентен гель-фильтрации при инструментальном анализе расход материала существенно меньше (гл. 12, 15, 17). [c.26] Статистическая обработка данных для 500 белков показала, что наиболее вероятная область молекулярных масс мономеров приходится на 0 000—60 000 [63]. Действительно, молекулярные массы субъединиц более чем 7з изученных к настоящему времени белков располагаются в указанном диапазоне. Примерно 50% этих белков составляют димеры, 30% — тетрамеры, 8% — гексамеры. [c.26] Каждому варианту свойственны собственные преимущества и недостатки. Общие принципы и методика эксперимента электрофореза в ПААГ подробно рассмотрены в ряде исчерпывающих публикаций [3, 35, 73, 183]. В ступенчатой системе образцы предварительно концентрируются в формирующем геле, после чего входят в рабочий гель в виде узких зон. В непрерывной системе предварительное концентрирование исключено и при нанесении образца в большом объеме по завершении электрофореза образуются широкие зоны. Если образец наносить в небольшом объеме, результаты в обеих системах должны быть идентичны. Наблюдающиеся иногда различия в результатах, возможно, обусловлены частичной диссоциацией комплекса при электрофорезе в ступенчатой системе. [c.27] При электрофорезе в градиентном геле полипептиды мигрируют до достижения зоны с определенной пористостью, препятствующей их дальнейшему продвижению. Если все комплексы полипептидов с ДСН имеют одинаковую форму, концентрацию ПААГ в этой зоне можно принять характеристической для данной молекулярной массы [97, 99, 101, 137]. Комплекс может частично разрушиться с потерей ДСН, в особенности в области, близкой к равновесному состоянию, однако это не влияет на конечный результат. Объем образца не влияет па ширину белковых зон, тем не менее наносить образец в большом объеме не рекомендуется. При электрофорезе в градиентном ПААГ формирование градиента с высокой воспроизводимостью может быть затруднительным. Однако для этих целей выпускаются преформированные гели высокого качества. [c.28] Аппаратура и реактивы. Полиакриламидные гели готовят в виде стержней в стеклянных трубках или в виде пластин последний вариант более удобен при определении молекулярных масс. При электрофорезе в трубках различная электрофоретическая подвижность может быть обусловлена изменениями степени полимеризации геля, а также зависеть от длины слоя геля, условий проведения электрофореза. Техника извлечения геля из трубок разработана детально [35] показано, в частности, что извлечение гелей с концентрацией мономеров более 10% бывает затруднительным. Рекомендации по использованию аппаратуры и меры безопасности при работе с реактивами обсуждаются в разд. 1.2,1.1. [c.28] После внесения персульфата раствор перемешивают до растворения кристаллов и быстро переносят в систему для проведения электрофореза. Следует принять меры против образования в геле пызырьков воздуха. Для этого на иглу шприца надевают отрезок тонкого шланга (силиконового, полиэтиленового), по которому осторожно по стенке наслаивают рабочий раствор мономеров. Гребенку для формирования лунок осторожно погружают в раствор, удаляют с зубцов пузырьки воздуха и выдерживают раствор до завершения полимеризации. Скорость полимеризации может варьировать в зависимости ог концентрации персульфата аммония и ТЕМЕД. В среднем полимеризация должна завершиться спустя 10—25 мин после добавления персульфата. Ускоренная или замедленная полимеризация плохо воспроизводится и может привести к образованию геля с неравномерными порами. [c.29] Непрерывная буферная система с постоянной концентрацией полиакриламида [182]. Основные компоненты этой системы 0,05 М фосфатный буфер и 0,1%-ный ДСН. [c.30] Электродный буфер готовят из запасного раствора путем разбавления дистиллированной водой в соотношении 1 4. [c.30] Образцы растворяют в буфере следующего состава 20 мл запасного буфера+ 1 г ДСН+ 10 г глицерина+ 0,05 г бромофенолового синего +дистиллированная вода (до объема 100 мл). При электрофорезе с целью определения молекулярной массы полипептидных цепей с восстановленными дисульфидными связями буфер должен содержать 1% (об./об.) 2-меркаптоэтапола. [c.30] После кратковременного нагревания до кипения образцы вносят в лунки геля с помощью микрошприца или микропипетки. Электрофорез ведут при 200 В до подхода зоны красителя к нижнему краю геля. Продолжительность эксперимента зависит от длины слоя геля и геометрии пластины. По завершении электрофореза проводят операции окрашивания, обесцвечивания и фотографирования (разд. 1.2.1.1). [c.30] Ступенчатая система с постоянной концентрацией полиакриламида [95]. Основные компоненты этой системы 0,375 М трис и 0,1%-ный ДСН. [c.30] Концентрация акриламида в рабочем геле 5%—25%, в формирующем геле (длиной 20 мм) 4,5%. [c.30] Рабочий буфер имеет следующий состав 1,5 М трис + 0,4% (масс./об.) ДСН, pH 8,8 (подтитрован НС1 до указанного pH). [c.30] Буфер формирующего геля имеет следующий состав 0,5 М трис + 0,4% (масс./об.) ДСН, pH 6,8 (подтитрован с помощью НС1). [c.30] Вернуться к основной статье